干旱胁迫对小麦高压诱变体的影响.doc

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1、 2011级硕士研究生学位论文开题报告干旱胁迫对小麦高压诱变体的对干旱胁迫的生物学响应影响The effect of high-Pressure induced wheat on the drought resistance学 院： 农业科学院 学科、专业： 作物遗传育种 研 究 方向： 作物育种理论与方法 研 究 生： 熊 建 云 指 导 教师： 张正茂 研究员 研究生通过开题论证日期： 年 月 日开题论证委员会主席签名： 开题论证委员会委员签名： 1.选题的目的和意义小麦新品种选育是促进小麦持续增产最直接最有效的措施之一。在小麦新品种的培育过程中，各种优良种质和材料的引入对提高育种效率和保

2、持遗传多样性至关重要，目前小麦育种中可供利用的优异种质资源范围已经非常狭窄，迫切需要不断发现和创造新种质和新材料的不断发现和创造，在现代育种中，转基因新技术、各种诱变处理育种等技术常被用来创造新材料。利用转基因新技术进行生物技术育种无疑是现有方法中最直接、最快捷的获得目标性状的有效手段，但该方法被警戒警告有可能应防护危害自然资源基础和土壤营养平衡和生物安全，以保证未来农业体系对环境形成尽可能小的危害。诱变育种是指利用各种理化因素诱发变异，再通过选择而培育新品种的方法，与常规育种方法相比，具有方法简便、育种周期短、效果好等特点，其在改良作物品种和创造新种质方面发挥了巨大作用，已成为世界上普遍应用

3、的先进育种方法之一，尤其是与杂交育种技术的结合，育种效果更为显著。目前在育种上应用的诱变方法有物理诱变法、化学诱变法和空间诱变法等。物理诱变法是指利用一些物理因素处理农作物种子、花粉、器官、植株，引起植物染色体发生畸变，诱发出新的可遗传变异，从中筛选出有利变异性状的后代，育成新的品种。物理诱变具有扩大变异来源，获得多种变异类型，提高有益变异频率的许多优点，是作物遗传改进和创造遗传新资源的核心和关键，是传统杂交育种技术的重要补充和难以取代的育种手段，从而越来越多的被用于现代育种技术中。随着全球气候变暖，水资源日益匮乏，干旱将成为农业发展的首要限制因子中国水资源匮乏，近年来小麦主产区干旱频繁发生，

4、危害日益加重，因此培育节水抗旱小麦品种尤为重要。2.选题的依据2.1 理论依据压力是影响化学反应速度和平衡以及蛋白质构型的基本热力学变量之一。Johnson在20世纪50年代就发现，麻醉后的蝌蚪经大约10MPa的压力处理后可以复苏。Saltveit等用12MPa的高压氦气和氮气处理植物组织，发现冷锻炼过的黄瓜子叶、黄瓜胚轴部分和西红柿果皮冷冻伤害的程度加重，膜发生相变导致柔顺性变化，植物冷冻伤害的阈值温度提高，并认为某些细胞成分可能受到影响。物理诱变剂主要有紫外线，X射线，-射线，快中子，激光，微波，离子束等。高压生物学是由高压物理学和生物学发展起来的一门新的交叉学科。近年来，随着高压物理学技

5、术的进步和分子生物学技术的发展，高压生物学已成为一个新的研究热点。高压能对生物体产生强烈的胁迫效应，高压处理能改变生物体的染色质的结构，影响遗传物质DNA的完整性，并能引起酵母、大肠杆菌等微生物基因表达模式的改变。高压诱变是使萌动的种子在高压环境中进行。在高压环境下合成蛋白质和DNA的小分子如氨基酸、核糖核酸、碱基以及酶的化学行为与在常压环境下有所不同，可能导致新复制的DNA在结构上产生变化。由于所有细胞都处于相同的高压环境，种植当代就可以产生相对集中的性状变异并迅速稳定。近年来，高压作为一种新的诱变源被引入到高等植物玉米的诱变育种研究中。高压处理可以诱导玉米在当代及后代中发生株高、分蘖数、生

6、长期、叶鞘及籽粒颜色等性状的变异，并获得了一些可稳定遗传的突变体。干旱是一个世界性问题， 世界上干旱、 半干旱区面积约占土地总面积的 36%。在中国干旱也呈加重趋势， 每年约有 4133.3 万 hm2的农田得不到有效灌溉。工业用水的剧增、环境的污染和气候变暖更加剧了水资源的短缺。水资源的贫乏已成为制约农业可持续发展的重大障碍。面对日益增长的人口压力和水资源日益匮乏的现状， 培育抗旱节水、 高产、 优质的小麦品种将是保障国家粮食安全、促进小麦生产持续稳定发的有效途径。差异蛋白质组学是研究有意义的因素引起的蛋白质组成的变化， 以发现有差异的蛋白质种类。 这种差异蛋白质组学的思想更注重把蛋白质组学

7、作为研究生命现象的手段和方法。 将差异蛋白质组学应用于植物研究中， 不需要捕获全部蛋白，只需找出不同时期、 不同组织或不同条件下所表达的可能涉及特定功能机制的蛋白即可，有很强的针对性和很高的可实现性，因而十分便捷。差异蛋白质组学作为专门的技术体系目前在植物生理、 植物组织器官和亚细胞、植物突变体、植物遗传多样性等多方面研究中都有运用。植物生存环境中的许多因子都可以引起植物体中大量的蛋白质在种类和表达数量上的变化， 研究这些差异蛋白可以使我们更好地了解植物对环境的信号应答和适应机制等。植物的不同细胞、组织或器官中均可检测到一些特异蛋白，尽管不同植物中这些特异蛋白在种类、数量和存在的时间上不尽相同

8、，但这些蛋白质很可能是体细胞或生殖细胞形成的特定时期特异基因的表达产物， 它们与该时期细胞的功能或组织的形态建成及机体的生理生化变化密切相关。因此，差异蛋白组学也能为植物发育过程中基因调控及等分子机制提供相关的信息。2.2 技术依据（1）2.2.1 蛋白质组研究技术 蛋白质组样品制备所遵循的原则是在制备的过程中要最低限度的质组成的任何定性或定量的变化，最大限度的保持蛋白质的原有状态，的分离出蛋白质。通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白也可以进行样品预分级， 即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分，分别进行蛋白质组研究。样品预先分级的主要方法包括根据蛋白质蛋白质在细胞中不同的细胞器定

9、位进行分级，如专门分离出细胞核、线尔基体等细胞器的蛋白质成分。 样品预先分级不仅可以提高低丰度蛋白量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。 2.2.2双向电泳技术二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是根据蛋白质的等电点和分子量大小不同，对样品蛋白进行分离的方法。2.2.3质谱技术生物质谱技术是蛋白质组学的一项支柱技术，可对双向电泳分离的蛋白质进行鉴定。质谱技术(MS)的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷比(m/z)的不同而变化，从而可以据其来判断粒子的质量。20 世纪80 年代后期，同时出现了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDTOF-MS)和电

10、喷雾质谱(EST-MS)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDITOF-MS)，是依据多肽离子的质量/电荷比值与数据库中蛋白经蛋白酶消化后的多肽片段的数据进行对比，找到分析蛋白的同源蛋白，这种方法也被称为多肽质量指纹分析。此方法操作简便，灵敏度高，是目前较常用的蛋白质鉴定方法。3.国内外研究概况压力是影响化学反应速度和平衡以及蛋白质构型的基本热力学变量之一。Johnson在20世纪50年代就发现，麻醉后的蝌蚪经大约10MPa的压力处理后可以复苏。一般认为高压对生物的生长发育主要是抑制或破坏作用，Saltveit等(1993)用12MPa的高压氦气和氮气处理冷锻炼后的黄瓜子叶、胚轴和西红

11、柿果皮等，结果发现这几种组织冷害程度均加重，且冷冻的极限温度升高。但是压力对于生物所起的积极作用也不容忽视。Yayanos等发现深水中存在着的嗜压微生物，只有处于高压的环境中才能正常生长和繁殖。徐世平等利用高静水压力处理水稻种子，对当代水稻的生长发育进行了研究和突变植株的筛选，结果表明，高压能够影响水稻的生长发育和遗传特性。李桂双等(2003)在同样的试验条件下又研究其生理特性、抗氧化酶活性及对逆境胁迫的响应。申斯乐等(2004)对高压处理水稻诱导稳定遗传变异系进行了DNA分析。吴学华等(2003)首次用高压氮气处理茄科类植物)微型番茄种子，发现高压对番茄生长特性有明显的影响，高压处理组中出现

12、异常高大植株的概率为3%6%；并且此性状在以后连续两代中能够稳定遗传。陈丽英等(2006)还对长春花进行了类似的试验,取得了提高药用成分的显著效果。2007年,龙国徽等人研究了高静水压对大麦种子萌发和DNA 分子指纹的影响,进一步证明了高压是诱导种子植物变异的一种行之有效的新方法。2003 年,西南交通大学高压物理研究所开始以氮气为传压介质,先后研究了高氮气压对长春花微型番茄、大豆生长发育的影响。研究表明,高压逆境锻炼有望成为植物诱变育种的一种新手段。陈凡国等采用高效毛细管电泳技术对普通小麦不同类型的愈伤组织进行差异蛋白质组学分析， 发现不同类型的愈伤组织中含有多数相同的蛋白质和少数差异蛋白质

13、。结合形态与结构分析，表明差异蛋白质可能与体细胞胚的发生和发育相关。并指出高效毛细管电泳技术具有快速可靠的特点，可望发展成为鉴定愈伤组织类型及体细胞胚发育时期特异蛋白质的有效方法。 突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一， 应用差异蛋白质组学技术对基因敲除突变体或转基因重组体与野生型个体间差异蛋白进行对比分析就可以对目的基因的功能进行分析研究，为突变背后的生理生化过程提供信息。霍晨敏等首次分析1%NaC1胁迫72h的1对小麦耐盐(RH8706-49)及敏盐突变体(H870- 634)的差异蛋白质组，经过MALDI-TOF分析和数据库检索发现5种可能在盐胁迫下对维持叶绿体及整个细胞的功能起到重

14、要作用的叶绿体蛋白。差异蛋白质是基因多样性和表型多样性的纽带， 通过差异蛋白质来检测遗传多样性也有许多成功的尝试。如David等比较了起源于同一种群但在不同环境下生长的小麦种群遗传多样性，认为这是其适应各自的气候条件而形成的。蛋白质的差异和变化是植物活动的重要方式， 发现并鉴定正常状态下和有意义因素影响下出现的差异蛋白质是认识植物生命活动的关键，而且，差异蛋白质组的研究结果可以丰富和促进植物全蛋白质组学的发展。随着各种技术的完善，差异蛋白质组学应用于植物中的研究将会越来越有其相对独立的价值和实际意义。4.研究内容4.1 高压诱变小麦突变株系干旱胁迫的的酶学生理指标检测响应4.1.1（1） 在灌

15、浆期测定高压诱变小麦的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、丙二醛(MDA)、可溶性糖测定和脯氨酸含量测定 4.1.2（2） 在灌浆期用叶绿素测定仪测定小麦叶片中的的叶绿素含量及用光合仪测定净光合速率、叶片气孔导度和蒸腾速率4.1.3（3） 测定小麦籽粒中的小麦蛋白含量和谷蛋白聚合体( GMP) 含量4.2高压诱变小麦的DNA分子指纹分析 以高压处理的两个小麦品种西农979、普冰476为材料，盆栽种植，对其DNA指纹分析，找出与未处理之间的差异。4.3 差异蛋白的提取，克隆，测序 将小麦的突变株系用盆栽种植，控制盆栽条件，时期处于干旱状态，并设置对照组。在灌浆期提取叶片中的总蛋白，进行双向电泳，并通过质谱技术分析差异蛋白。5. 研究方法及技术路线试验于西北农林科技大学北校区试验地进行，实验材料为高压诱变小麦材料G4110的稳定遗传后代，26个诱变系和未诱变的对照，种植成27个小区，以便进行测定各种性状，每个小区行长1.5M，行距0.25M，共10行。5.1 各种生理指标的测定时期与方法开花灌浆时期是小麦对外界环