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1、生物化学期刊VOL. 281, NO. 17, pp. 1175511760.存在于透明质酸合酶家族中的两种膜内极性残基的突变能改变透明质酸产物的大小卡玛里库玛丽,布鲁斯把根斯透斯 ,安德里亚诺夫艾克,保罗格尔1来自于生物化学和分子生物学领域及关于医学的糖生物学俄克拉荷马州中心和俄克拉荷州健康科学中心大学摘 要 我们识别了两种在链球菌不同细胞膜结构域的透明质酸存在两种保守的极性氨基酸，如存在于膜结构域2的赖氨酸和存在于膜结构域4的谷氨酸。在真核生物的透明质酸合酶中，谷氨酸的位置一般非常相似，并且赖氨酸由保守的极性谷氨酰胺所代替。为了评估是否赖氨酸和谷氨酸作用于或影响于链球菌透明质酸合酶的活性，
2、我们调查了把赖氨酸替换成精氨酸或者谷氨酸，还有谷氨酸替换成赖氨酸、精氨酸或谷氨酸的影响。包含赖氨酸和谷氨酸被替换的双开关的变异体在大肠杆菌细胞膜内得到表达和分布。尽管SeHAS（E327Q）和seHAS(E327K)低水平表达，然而seHAS（E327D）和Lys48表达比较好。这些特定的酶活性（相对于野生型）对于K48R和K48E突变体分别为17%和7%,并且对于E327Q和E327D突变体分别为26%和38%。相反，seHAS（E327K）只表现出野生型酶活性的0.16%，但是当把Lys转变成Glu之后，seHAs（E327K）的酶活性能够提高46倍。根据色谱层析分离方法加上多角度激光散射
3、，所有的 突变体合成了平均摩尔质量比野生型（3.6MDa）小的透明质酸，最小的HA（0.6MDa）来自于seHAS（E327K，K48E）和seHAS（K48E）。这个结果表明了存在于MD4的Glu对于seHAS的稳定性是非常重要的物质，并且这些残基涉及到能够使HAS合成摩尔质量非常大的HA。关键词 透明质酸合酶；透明质酸；赖氨酸；谷氨酸；SeHAS；HA产物大小；大肠杆菌； 1934年，Meyer和Palmer发表文献之后，透明质酸无所不在，经常大量存在于脊椎动物组织的细胞外基质组分中，尤其存在于软骨、皮肤和玻璃体液中。HA也可以由多种致病细菌产生。HA是一条线性非分支交替地多聚分子，由（1
4、，4)-N-乙酰葡糖胺和（1，3）-D-葡糖醛酸构成。传统的HA是非常多分散的。经典的最小分子100KPa,最大的分子接近于10MPa。HA是由HAS合成。自从1993年第一次HAS gene出现于链球菌Group A之后，相似的HAS gene已经在其它细菌、蛙类、人、其它的哺乳动物以及甚至在一些干扰藻类（1014）的病毒里面。这些大于20的HAS组成了一个拥有共同特点和AA序列相同或相似区域的蛋白家族。这种存在于巴氏杆菌的酶只是一种HAS但并不属于这个大家族，因为它在其结构、拓扑结构和作用机制的不同。 尽管在结构上简单，HA对于脊椎动物的正常发育是必要的，并在正常的健康和各种疾病中扮演着非
5、常重要的功能。很多研究已经达成共识：HA不仅仅是一种结构分子，并且是一种能够调整包括形成心脏垫、血管再生术及多种抗药性等复杂细胞行为的细胞信号。令人惊讶的是，很多这些细胞信号作用是由较小HA的调节，而不是较大MM HA。例如，血管再生（16，17） 被较小的HA所刺激，而不是较大的HA，并且能活化巨噬细胞，从而达到促进表达大量只反应成小HA的基因。小分子HA片段通过特定细胞表面受体来刺激信号连续传递给靶细胞，。因此，在特定的糖蛋白CD44（18）中，小分子HA和大分子HA可能对其有不同的生物学功能。 逐渐达成的共识表明，特定生物反应可能很好依赖于特定大小网状的HA。还发现了，尽管他们催化相同的
6、反应，但是不同的HASs产生HA的大小不同，一般为（2022）。例如，来自于能表达HAS 1或HAS 3细胞的膜合成0.22.0MDa的HA，然而大于2MDa的HA分子由来自于能表达HAS 2细胞膜上合成的。如果相同的结果适用于活的人体细胞，由HAS1、HAS2或HAS3合成的实际HA大小分布对于特定的生物学功能是不同的。这些人类HAS geng的表达方式在不同的成年和胚胎组织中是截然不同的。就像在胚胎发育过程中暂时的表达模式一样，不同大小的HA由三种HAS同工酶在不同时期和特定组织中合成。因此，这些HA可能涉及不同的生理学功能。 当前，通过能调整HAS活性的细胞和影响有HAS产生HA大小的因
7、素，人们对理解这些作用机理产生很大的兴趣。这是第一次关于由大小分离色谱法及多角度激光散射方法分析由包含野生型或突变型的细胞膜合成HA的摩尔质量的报道。在近来的研究中，我们检测了两种保守并且处于不同膜结构域的AA，其对于HAS功能至关重要。这些结果显示了，它们涉及到HAS能合成高摩尔质量HA的能力，并且支持了一种假说：MD2和MD4足够的近为这两种残基的直接作用于HA的相互作用提供可能。1. 位于HAS膜结构域的极性AA残基的突变能改变HA的大小1.1 实验过程1.1.1 载体、引物和试剂表达载体pKK223来自于安玛西亚公司。大肠杆菌SURE细胞体和点突变试剂盒来自Stratagene。突变的
8、寡核苷酸由Genosys（Spring，德克萨斯州）生物技术有限公司合成并由反相色谱分析进行纯化。Cy-5荧光测序引物由分子生物学资源装备所合成。其他的寡核苷酸引物由UDP-GLcUA和UDP-GIcNAC分别来自于Fluka和Sigma公司。UDP-14CGLcUA（300mCL/mmol）来自于铂金埃尔默生物科学院。所有其他的试剂是最高等级，都来自于Sigma除去个别标记。1.1.2 定点突变发生在3-端带有编码His6尾巴融合物的seHAS基因克隆导入pKK233(25).定点突变有意意引物设计成将Glu变成Gln（5-CTATGGACCATACTTCAGGTGTCTATGTTTATG)
9、,Asp(5-CTATGGACCATACTTGATGTGTGTATGTTTATG)，或Lys48转变成Arg（5-GCTTACCTATTAGTCAGAATGTCCTTATATCCTTT）或Glu（5-GCTTACCTATTAGTCGAAATGTCCTTATCCTTT）。编码感兴趣突变的两互补寡核苷酸引物用于制造单一AA突变，SeHAS（K48E，E827K）二突变基因用单AA突变的质粒DNA作为模板合成。突变生成是根据制造商的指导下用Quikchange来进行的。含有seHAS His基因的pKK233质粒在SURE细胞中合成，用旋转纯化盒纯化，其作为模板用于与一对突变基因引物的引物延伸反应，
10、用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，条件如下：95 1min，58 1min，68 18min 16个循环过后，突变的质粒经二磷酸吡啶核苷酸热处理后去消化甲基化和半甲基化亲本DNA。经消化的pDNA导入SURE细胞，克隆子得到筛选后用于进行感兴趣的突变。通过用荧光标签的终端剂（ABI棱柱377型号程序）对单一的pDNA进行测序，挑选出来的突变基因的完整阅读框通过用Cy-5标签的载体引物在法马西亚阿尔法快速DNA测序仪上进行双向测序，数据用ALF Manager进行分析。SeHAS突变体的酶活性大肠杆菌SURE细胞（其内含有各种seHAS突变基因的质粒）在鲁利亚培养基介质中子32下培养至A60
11、00.8并用1mM异丙基硫代-半乳糖苷诱导3h获得细胞，其如钱数一样准备细胞膜。SeHAS变异体的特定活性在37 ，50mM磷酸钠和磷酸钾缓冲液，p为7.0，加上20mM MgCl2，1mM DTT,0.1mM 苯甲基磺酰氯，1.0mM蛋白酶抑制剂和2uM 亮氨酸蛋白酶抑制剂，240uM UDPG-GlcUA,0.7uM UDP14CGlcUA,0.6uM UDP-GlcNAC 组成的100ul 的体系中得到测定。细胞膜（含0.540ugPr）加入体系起始酶反应，需加入SDS终止反应，使其在体系的终浓度为2%，并且HA中14CGlcUA的加入使其能通过递减的纸层析来得到测定。所以的样品用2个或
12、3个独立的膜标本以双份或三份进行分析。结果用平均数来表示。实验在时间和蛋白质浓度成线性的条件下进行。Km值和Vmax值如前述所述通过Tiapak-simmons进行测量。1.1.3 膜上SeHAS蛋白浓度的测定和SeHAS活性的标准化含有野生型或突变型seHAS的大肠杆菌细胞膜经溶解并在10%SDS-PAGE电泳.在每种膜标本中seHAS蛋白通过凝胶染色图像分析进行量化.膜中seHAS带的调整值与纯seHAS去评估膜中蛋白的seHAS蛋白含量的标准曲线进行对比,然后这些数据用于标准化膜内变异HAS活性相对于野生型。1.1.4 由seHAS变异体产生的HA产物大小的测定由野生型或突变型seHAS
13、合成HA的绝对质量通过不加标签的HA产物的SEC-MALLS分析进行测量。对研究包含HAS的膜合成HA的SEC-MALLS程序的有关记录在其他方面有更多详细的描述。膜在0下通过超声波进行破碎，再加入0.51.0mL的试验缓冲液（在微星离心管中），在上面制备一样，但需要加入2%的甘油、0.1mM EDTA但物MgCl2或底物，加入UDP-GlcUA和UDP-GlcNAC，使其终浓度为1mM。以上混合物在30温育10min，然后加入小牛肠碱性磷酸酶使其终浓度为0.02U/uL，接着添加MgCl2使其终浓度为20mM。最后，样品在30下在振动的小型冰槽搅拌器中温育4h。此反应通过加入EDTA和UDP
14、(最终的浓度分别为40mM和10mM)，在冰上冰浴20min，然后在100下沸腾使磷酸酶失活。用两种Plaquagel-OH 60凝胶色谱柱连续地以0.5mL/min的流速在50mM磷酸缓冲液、PH为7.0、150mMNaCl中，在22下对样品进行色谱分离，顺序地用DAWN DSP激光测光计和OPTIAB DSP折光计进行MALLS分析（都来自Wyatt技术）。在微星离心管中的20ul样品在注射之前先在100下沸腾2min，然后用Astra v4.73进行分析数据，dn/dc的值为0.153 ，A2值为0.0023并且一介导数和二阶导数分为HA2MDa.1.1.5 总结前面提到由Lee和Cor
15、rman制备琼脂糖凝胶电泳通过Bradford方法用小牛血清蛋白作为标准蛋白对样品蛋白进行测定。西方是根据Burnette程序用带有并如前面所描述的修饰的多克隆白兔的抗体IgG对saHAS进行分析。 1.2 结果及其讨论 HAS家族成员的AA排列展现出几种比较保守的存在于MDs的带电或极性残余物。尽管这些AA出现在许多蛋白质中，但带电或极性AA在MDs并不是经常能发现，因为当它们出现在疏水的双层磷脂分子中时，它们制造一种不利的能量形式。一种机能能缓它们的作用，就是必须有两种极性或带有相反电荷的AA存在于附近并能够形成一对离子对或者是氢键。例如，在MDV中乳糖通透酶中的Arg144能于在MDVI
16、II的Glu269形成氢键，这种相互作用促进排列及稳定在Arg144和底物乳糖之间氢键的形成。图1.关于SeHAS的Lys48和Glu327的细胞膜内极性对大多数HAS家族中是保守的。这种部分的排列展现出AA序列在对应于残基Lys48和Glu327的区域附近的AA序列。这两种残基在三种链球菌(乳房、链球菌、脓疮）的HAS中是完全保守的。尽管不相同，但是这两种残基在大多数真核HAS家族中总体是保守的，比如，来自于鸡、鼠、蛙、人或藻病毒。根据含有Lys48的seHAS，所有其他带有相似极性残基Glu的HAS家族，在相同的位置，这些含Glu327的seHAS在位置上是保守的。所有真核家族成员包含了在seHAS位置三种残基内高度
