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1、克隆文库分析,leolvcxm99 L,内 容,文库评价 序列的拼接 载体去除 嵌合子去除 BLAST比对 RDP归类 系统发育树构建 序列提交,文库评价,文库评价：主要是指对构建的克隆文库中酶切的克隆子个数是否能够代表整个环境绝大多数微生物类群，以及如何科学性的进行选择酶切克隆子数。,酶切克隆子个数选择策略,单文库：每次以100个克隆为基数进行酶切，切完后对库中只出现一次的条带进行统计，简单计算其所占比重，覆盖率达到80%左右即可。 多文库：每次以50个克隆为基数进行酶切，分别进行计算覆盖率，其中任何一个达到60%左右即可。,例. 单个文库,可以尽量的选择到曲线变的平滑阶段，,例. 多个文库
2、,对比性的去取，其中任何一个样品若出现有变得缓慢即可停止。,稀有度曲线分析,采用EstimateS 8.0软件进行稀有度分析。 (http:/viceroy.eeb.uconn.edu/estimateS) 软件使用如下：,数据录入,文库名称,OTUs数：首行为总个数,酶切的克隆个数：首行写总个数，次行从1开始按自然数排列,格式行：此行全部为写为1,格式行：此行全部为写为-1，表示结束,软件操作,结果,稀有度曲线制作,以 individuals 为横坐标，Sobs为纵坐标在Excel 中作曲线。,稀有度曲线,序列拼接,序列拼接：是指测序反应将一个长度大于1000bp的序列分别于两端进行测序所得
3、的两个序列进行拼接在一起。 使用软件contig,软件操作,测序返回的结果,ab1格式的文件是指带有测序峰图的序列文件，序列拼接首选该文件。,载体去除,由于测序常常使用的是载体上的序列，因此需要将所测序的结果进行去载体。 载体的去除，使用NCBI数据库中的sequence analysis 中的vecscreen. http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/,载体去除,嵌合子剔除,运用CHECK_CHIMERA (http:/wdcm.nig.ac.jp/RDP/cgis/chimera)对测序所得的细菌16S rRNA 基因序列进行嵌合子序列的检查和剔除,BLAST序列比对,登录
4、NCBI主页（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/） 选择BLAST 然后选择,BLAST序列比对,输入序列,输入菌株编号,比对结果,比对结果处理,对比对得到的结果进行处理：建立一个word文档将相似性较高的序列复制粘贴进文档。如图,这样做的目的是能够快速，方便的对标准菌株进行选择。,标准菌株的选择,标准菌株的选择：根据自己未来所要写的文章的内容的论据来进行选择。由于克隆文库所得的序列大部分为不可培养类群，因而标准菌株的选择要选取与你环境相似，并且在分类上具有较为详细的分类的菌株。 总体标准：尽量选择具有相似性高的纯培养菌。,RDP归类,克隆文库所得序列往往是一些不可培养类群
5、，因而很难确定其具体分类地位，因此选择使用RDP Classifer在线归类系统。 （http:/rdp.cme.msu.edu/index.jsp）,RDP归类,RDP归类,输入序列,RDP分类,置信度调至95%,此处为具体分类，但需要进一步的看归类的置信度,RDP分类,带有置信度的分类,重新开始点此处,系统发育树的构建,系统发育树的构建：目的是用于对克隆序列进行进一步的精确地归类。 注意事项：1）克隆的序列不能有反向序列（主要是测序时产生的）2）标准菌株的选择（尽量选择具有具体种属信息的序列，或者相似环境下的序列）3）对树要多计算几次来评估树的稳定性。,系统发育树构建,如何判断序列是反向序
6、列： 1）第一种：在BLAST序列比对时对自己的序列与网上的序列进行比较看你们的序列是否是从小到大排列对应的（也就是说你的序列是8F应该对应的是别人的8F或者小的） 2）第二种：预先将所有的序列构建一次系统发育树，如果有出现进化距离特别远的序列，该序列为反向序列的可能非常大。,此处序列为反向序列,反向序列修正,系统发育树构建,系统发育树构建使用软件MEGA 4.0。具体方法参考进化树制作过程。,序列提交,序列提交目的是为了获得Genebank登录号，一般的文章都需要并且非常重要。 序列提交首先要使用软件sequin进行编辑。 其次将编辑好的序列用邮件发送至Genebank编辑邮箱，一星期左右就
7、会得到序列登录号。,序列编辑,首先将确定分类的序列进行编辑，可以将同类（同门）菌株放入同一个文件夹。 格式：建立一个*.TXT的文档，里面键入的格式如图。,sw-xj83 organism=uncultured actinobacterium,strain=sw-xj83 uncultured actinobacterium clone sw-xj83 16S ribosomal RNA gene sequence.,序列另起一行顶格输入,Sequin序列编辑,选择所提交的数据库,开始提交,输入一个名字，名字可以是你未来要发表文章的名字或者也可以填写Direct submission。,输入名字，邮件电话等，此步很重要！,若每次只提交一个序列可以选择这个选项,此处为批量提交,此处导入序列,此处可以忽略,此处必须进行修订，双击点击进行修订,出现错误基本是此处缺失序列的具体分类信息，点击lineage,添加完分类信息后点击此处,若无任何问题按上述地址发邮件,谢 谢,
