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1、第一部分第一部分 DNA 酶处理：试剂为酶处理：试剂为 PROMEGA( RQ1 RNase-Free DNase ) 目的：失活 DNase 酶 RNA（TE 洗脱） 8 微升 RQ1 RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1 微升 RQ1 RNase-Free DNase 1 微升/微克 RNA 合计 10 微升 37 30 分钟孵育 加 1 微升的 RQ1 DNase 终止液 65 10 分钟使 DNase 酶失活 （PS:经验 这一步最好在核酸提取之前就处理好，具体步骤如下：取样本 反复冻融三次，然后一万转离心十分钟，取上清，用 0.22 微米的滤膜
2、过滤，加 DNase，提核酸） 第二部分第二部分 RNA-seq system V2(cat.7102) 目的：生成并纯化 cDNA 一、第一链合成 1. 融解第一链 cDNA 合成试剂（蓝色盖）和无核酸酶的水（绿色） 2. 短时离心 A3ver1 放在冰上，votex A1Ver4 和 A2ver3，离心后放在冰上；无核 酸酶水放在室温； 3. 在冰上，取 2ul A1 和 5ul total RNA （500pg 到 100ng）放在 0.2mlPCR 管里； 4. 将 PCR 管放在 PCR 仪中运行程序 1： RNA 量 1ng 时，65 2min，4 存放 RNA 量 1ng 时，6
3、5 5min，4 存放； 5. PCR 仪降到 4后取出 PCR 管放在冰上，加入制备好的第一链合成试剂，每 个样本加入 3ul，混匀后，离心放在冰上： 第一链合成试剂：2.5ul buffer mixA2+ 0.5ul 酶混合液 A3（共 3ul） 注意：加酶 A3 时要慢慢加入，反复吹打枪头至少 5 次确保酶加入进去 6. 把加入第一链合成剂和样本的 PCR 管放在 PCR 仪上运行程序 2： 4 1min，25 10min，42 10min，70 15min，4hold 二、第二链合成 1. 重悬 RNAclean XP beads，放在室温备用 2. 融解第二链合成试剂（黄盖） 3.
4、瞬时离心 B2Ver2，放在冰上。 ，votex B1Ver3，离心后放在冰上； 4. 每个样本中加入 10ul 第二链合成混合液（9.7ul buffer mix B1+0.3ul B2 Enzyme mix） ，轻轻混匀，放在冰上； 5. 把 PCR 管放在 PCR 仪上，运行程序 3： 4 1min，25 10min，50 30min，80 20min，4hold 6. PCR 仪降到 4后取出 PCR 管，放在冰上，进行 cDNA 纯化。 三、纯化 cDNA 1. 确定 RNAclean XP beads 室温平衡，颠倒混匀（PS:需要提前取出室温平衡半 个小时以上，用之前需重新混匀并
5、马上离心使用） 2. 在上述反应体系中加入 beads32ul，吹打混匀 10 次； 3. 室温放置 10min； 4. 把管放在磁力架上，放置 5min，吸出 45ul 结合 buffer，加入 200ul 新鲜配制 的 70%乙醇，放置 30sec，用加样器吸出乙醇，重复洗涤 3 次；最后洗涤后吸出 多余的乙醇，室温干燥 15-20min，确保不案子完全干燥没有乙醇残留；继续进 行 SPIA 扩增。 四、SPIA 扩增 1. 融解 SPIA 扩增试剂（红色盖） ； 2. 取 C3ver7.5 颠倒混匀，瞬时离心后放在冰上，votex C1Ver9 和 C2ver11，离 心后放在冰上； 3. 每个样本中加入 SPIA master Mix40ul： 20ul buffer Mix C2 +10ul primer Mix C1+10ul Enzyme mix C3 ，与 beads 充分混匀，放在冰上； 4. 把 PCR 管放在 PCR 仪上，运行程序 4 4 1min，47 60min，80 20min，4hold 5. PCR 仪降到 4后取出 PCR 管，放在冰上，进行扩增产物 SPIA cDNA 纯化或 者储存在-20。 五、纯化 SPIAcDNA 用 Qiagen minElute reaction cleanup kit 进行纯化。
