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1、电离辐射的细胞和组织效应,中国医学科学院肿瘤医院放疗科 杨伟志,临床放射生物学在放射治疗中的作用和地位,“生物学”与“医学” “微观”与“宏观” “经典理论”的现实意义,临床放射生物学在放射治疗中的作用和地位,从实验室到临床的桥梁 提供理论基础，阐述放射治疗的生物学原理 治疗策略及验证 个体化放射治疗方案的研究和设计,二.电离辐射的直接作用和间接作用,电离辐射的直接作用 任何形式的辐射，X （）射线，带电或不带电粒子被生物物质吸收后都可能与细胞的关键靶DNA直接发生作用， DNA本身的原子可以被电离或激发从而导致一系列生物变化的事件，这被称为辐射的直接作用。 高LET射线（如中子、粒子）主要是
2、直接作用,电离辐射的直接作用和间接作用,电离辐射的间接作用 辐射也可与细胞内的其它原子或分子（特别是水）相互作用，产生自由基，这些自由基可以扩散到足够远，达到并损伤关键靶DNA，这被称为电离辐射的间接作用。 自由基是一种游离的原子或分子，外层携带不成对轨道电子。,从入射光子的吸收到最终生物效应的产生，X射线的间接作用：,入射X射线光子 | 快速电子 | 离子自由基(H2o H2o+ + e) | 自由基(H2o+ + H2o H3o+ +OH ) | 高活性 由化学键断裂引起的化学变化 | 生物效应,OH,插图,三.电离辐射的细胞效应,分子水平 DNA链损伤 DNA链修复 细胞水平,电离辐射的
3、细胞效应,辐射诱导的DNA损伤及修复 研究显示：DNA是引起一系列生物学效应的关键靶。 DNA链断裂的主要形式 单链断裂 双链断裂,插图,电离辐射的细胞效应,DNA链断裂的修复 DNA单链断裂的修复 以对侧链为模板，是一种可完全修复的分子损伤 DNA双链断裂的修复 可修复的双链断裂（彼此分开间隔一段距离） 不可修复的双链断裂（发生在对侧互补碱基或仅间隔几个碱基对-染色体折成两段）,电离辐射的细胞效应,DNA双链断裂的修复 两个基本过程 同源重组（Homologous recombination) 在修复中需要未受损的DNA链参与，末端与末端经非同源重组相接。 非同源重组（nonhomologo
4、us(Illegitimate) recombination 没有模板存在，无法指导缝隙的填充。因此容易发生错误。所以也称之为非法重组,插图,电离辐射的细胞效应,辐射所致的细胞死亡. 两种主要形式 分裂间期死亡（细胞在进行下一次分裂前死亡） 有丝分裂死亡 (增殖性死亡） 指由于染色体的损伤，细胞在试图分裂时发生死亡。死亡可发生在照射后的第一次或以后的几次分裂。是电离辐射引起细胞死亡的最常见形式，,电离辐射的细胞效应,辐射引起细胞死亡的关键靶在细胞核 放射性同位素（如3H,125I）掺入核DNA可有效地造成DNA损伤并杀死细胞。 受放射线照射后染色体畸变率与细胞死亡密切相关。 当特异地把胸腺嘧啶
5、类似物，如碘脱氧尿核苷或溴脱氧尿核苷掺入染色体时可修饰细胞的放射敏感性,电离辐射的细胞效应,放射生物对细胞死亡的基本认识： 一般意义的细胞死亡（cell death)， 细胞再繁殖完整性的丢失(loss of reproductive integrity of tumor cells) 两者在概念上存在着根本意义上的不同，放射可治愈性结局的最主要依据是后者。 放射治疗对受照射后的存活细胞更加关注，因这对放射可治愈性非常重要,细胞存活曲线 描述放射线照射剂量和细胞存活比之间的关系， 关注的是：一定剂量照射以后对克隆源细胞而不是细胞群任意细胞的杀灭,电离辐射的细胞效应,电离辐射的细胞效应,细胞存活
6、曲线 放射生物学规定： 鉴别“细胞存活”的唯一标准是照射后细胞是否保持再繁殖的完整性，即所分析的是克隆源细胞的增殖活性而不是受照射群体中任意细胞的功能活性 MTT法、染料除外等方法均不被认可,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 克隆源细胞（clonogenic cell) 指具有生成“克隆”能力的原始存活细胞。 在离体培养细胞：这种无限增殖能力体现为形成一个完整的50个细胞的克隆 在体内：体现为肿瘤体积的不断增大、复发、转移 在这个“细胞存活”的严格定义下，提示临床必须重视这种存活细胞，这种具有无限增殖能力的细胞是在治疗中必须根除的细胞,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 细胞形成克隆的能力被称为
7、“细胞存活” 辐射所致的细胞杀灭是指数性的， 指数关系的特点：增加一定剂量就有一定比例的细胞而不是数量的细胞被杀死,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 主要实验方法和步骤 细胞培养，- 指数生长期或相对密度生长期（平台期） 测定细胞系的克隆形成率（Plating efficiency,PE) 测定照射后细胞的存活分数(survivingfraction,SF) 根据各照射剂量点的存活分数作图 绘制细胞存活曲线，计算曲线参数,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 实验设计原则及注意事项 实验所采用的细胞系应具有一定的克隆形成率（50-90%） 应设6-8个照射剂量点，肩区点要够（应包括0，1Gy,2G
8、y)，以保证低剂量区效应的准确性,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 根据细胞类型，高剂量区的终末剂量点应够大，是细胞杀灭达到一定数量级 根据细胞周期时间确定合适的培养时间（9-14天），培养时间过长细胞会因营养不良而脱落,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 克隆培养用容器不应太小（不赞成使用孔板和扩散盒等），以60-100mm平皿最常用，容器太小所能容纳的细胞数不足以达到上述标准，且难以分散均匀。 克隆形成期间不能换液，以保证克隆形成的准确性。,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 应计数大于50个细胞以上的克隆 选择合适的数学模型进行曲线拟合，应注意不同模型间的参数不能互用 实验结果的分析只能采用
9、存活曲线参数间的比较，不能用单剂量点存活分数直接比较（因放射生物分析的是产生相等效应所需的照射剂量，不是相同剂量产生的效应差别）,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 细胞存活曲线的形状 指数存活曲线 对于致密电离辐射（如中子、粒子），照射后细胞存活曲线用单靶单击数学模型拟合后，在半对数坐标上是一条直线，呈指数型。 非指数存活曲线 对稀疏电离辐射（射线、射线等），照射后细胞存活曲线的起始部（低剂量段）在半对数坐标上有一个有限的初斜率，在肩段存活曲线出现弯曲，在高剂量段存活曲线又趋于直线,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 指数存活曲线的数学模型 单靶单击模型（single-hit multi-tar
10、get model) 数学表达式： SF=e-D e为自然对数的底； 为与射线的质及放射敏感性有关的常数 曲线参数： D0 平均致死剂量,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 非指数存活曲线的数学模型 多靶单击模型（single-hit multi-target model) 由Elkind 和 Whitmore提出，其数学表达式为： SF=1-(1-e-kD)N 曲线参数： D0 平均致死剂量 Dq 准阈剂量 N 外推数,电离辐射的细胞效应,细胞存活曲线 线性二次模型（linear-quadratic model) 线性二次模型假设，辐射杀灭细胞有两部分，一部分与照射剂量成比例，另一部分与照射剂
11、量的平方成比例。 数学表达式 S = e-D-D2 S是照射剂量为D时的细胞存活， 和是常数。,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期的基本概念 一个世纪以前，人们已了解到多细胞动物细胞繁殖的基本机制是有丝分裂 哺乳动物细胞通过有丝分裂繁殖和传代 一个细胞分裂时会产生2个子细胞（每个子细胞都携带一套与母细胞完全相同的染色体 两次有效的有丝分裂之间的时间，称为细胞周期。,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期、时相 显微镜观察（早期） -有丝分裂期细胞 分裂间期细胞 放射自显影术（1953）- 细胞周期时相 细胞光度术（1948） 流式细胞术 - 细胞周期时相,细胞周期时相,细胞周期时相与放射敏感性,细
12、胞周期中不同时相细胞的放射敏感性 有丝分裂细胞或接近有丝分裂细胞最放射敏感（G2和M期的细胞是最放射敏感的） 晚S期的细胞通常具有较大的放射耐受性 若G1期较长，G1早期较G1晚期相对放射耐受（G2期细胞在分裂前没有充足的时间修复放射损伤）,Sinclair和Morton（1965）,不同周期时相仓鼠细胞的放射敏感性变化,细胞周期时相与放射敏感性,细胞周期再分布的意义 一般认为，分次放射治疗中存在着处于相对放射抗拒时相的细胞向放射敏感时相移动的再分布现象，这有助于提高放射线对肿瘤细胞的杀伤效果。 如果未能进行有效的细胞周期内时相的再分布，则也可能成为放射抗拒的机制之一。,四.电离辐射对肿瘤组织
13、的作用,肿瘤的增殖动力学 肿瘤的细胞动力学层次(cell kinetic compartments of a tumor) 根据动力学特性分4个层次： 第一层次：由活跃分裂的细胞组成(也称“P”细胞） 所有细胞都将通过细胞周期 可用细胞标记技术进行辨认 该层次细胞在整个肿瘤细胞群体中所占的比例成为生长比例（growth fraction, GF),电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的增殖动力学 第二层次 由静止（G0)细胞组成 非增殖细胞的层次(Q细胞或静止细胞） G0细胞可再进入细胞周期 有些G0细胞是克隆源细胞（可再群体化出一个肿瘤） 第三层次由分化的终末细胞组成 不再具有分裂能力 第四层次
14、由死亡和正在死亡的细胞组成 细胞从一个层次向另一个层次的转化是连续发生的 Q层次向P层次的移动成为再补充（recruitment),电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的生长速度 描述肿瘤生长速度的3个参数： 1.肿瘤的体积倍增时间 （tumor volume doubling time,Td ) 由3个主要因素决定： 细胞周期时间（the cell cycle time) 生长比例 (the growth fraction) 细胞丢失速率（the rate of cell lose),电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的生长速度 2.潜在倍增时间（potential doubling time,Tpo
15、t) 指假设在没有细胞丢失情况下肿瘤细胞群体增加一倍所需的时间（Steel ,1977)。 Ts Tpot = _ LI Ts：s期持续时间，LI：标记指数， ：校正系数（0.7-1.0）,电离辐射对肿瘤组织的作用,肿瘤的生长速度 3.细胞丢失因子（cell loss factor) Tpot 细胞丢失因子 = 1 - Td 许多人肿瘤生长较慢，主要是因为细胞丢失率高。 细胞丢失的主要机制：坏死 分化,肿瘤生长速度,人肿瘤典型的动力学参数 - 细胞周期时间（-2天） 生长比例 （-40%） 潜在倍增时间（-5天） 细胞丢失 （-90%） 体积倍增时间 （-60天） -,电离辐射对肿瘤组织的作用,放射治疗中的剂量-效应关系 剂量-效应关系的概念 指即定物理吸收剂量与放射生物效应结果及影响因素之间的关系。 我们在临床上所看到的是一个广泛的剂量范围，在这个范围特定类型放射反应的风险随照射剂量的增加从0%-100%，,电离辐射对肿瘤组织的作用,放射治疗中的剂量-效应关系 剂量-效应曲线的形状 电离辐射的剂量-效应曲线呈“S”形 随剂量趋于“0”，辐射效应的发生率也趋于“0” 在高剂量时辐射效应趋于“100%”,剂量-效应曲线的形状,电离辐射对肿瘤组织的作用
