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1、动物细胞工程,动物细胞工程常用的技术手段：,动物细胞培养、 动物细胞核移植、 动物细胞融合、 单克隆抗体 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,提问：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养, 植物体细胞杂交,阅读思考：,为什么要进行动物细胞培养？ 什么是动物细胞培养？,一 动物细胞培养,动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的 组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适 宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,思考：动物细胞培养的过程是怎样的呢？,阅读思考：,为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？ 怎样分散？,用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要 成分是什么？用胃蛋白酶行吗？,
2、3 什么是细胞贴壁和细胞接触抑制？,什么是原代培养和传代培养？传代培养的细胞 具有 什么特点？,为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？怎样分散？,1.成块的组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增值。 2.从健康动物体内取出组织块，剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理,用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分 是什么？用胃蛋白酶行吗？,1.在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。 2.动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,动物细胞生长特性：,细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴
3、附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,什么是原代培养和传代培养？ 传代培养的细胞具有什么特点？,原代培养：将动物组织用胰蛋白酶处理成单个细胞，配制成一定浓度的悬浮液，放入培养瓶中在培养箱中培养的过程 传代培养：培养瓶中的细胞越来越多，用胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成悬浮液，分瓶培养的过程,动物细胞培养过程,胚胎或幼龄动物的组织器官,细胞悬液,10代细胞,50代细胞,剪碎,胰蛋白酶,洗涤、稀释、分离,原代培养,用胰蛋白酶分散细胞，说明细
4、胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越强，越容易培养。,动物细胞培养不能最终培养成生物体,细胞增殖缓慢，核型可能变化,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,贴壁生长 接触抑制,10代以内，保持正常二倍体核型,传代培养,细胞系,细胞贴壁 表面光滑、无毒，易于贴壁。,5%CO2。维持培养液的pH,讨论：,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境知识，
5、思考并讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物资？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境件？,充足的营养(葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子和动物血清等。) 气体,无菌、无毒的环境 适宜的温度和PH,动物细胞培养条件：,1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,保证细胞顺利的生长增殖,动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,（1）液体培养基,（2）含
6、有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,动物细胞培养应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据,1、在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（ ） A细胞一直在细胞悬液中分裂生长 B有少部分细胞可能在培养条件下无限地传代下去 C有部分细胞核型会发生变化 D. 个别细胞会发生基因突变,2、下列过程与细胞培养无关的是-（ ） A.检测有毒物质 B.生产单克隆抗体 C.筛选抗癌药物 D.杂交育种,A,D,练习：,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：在
7、培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强调二：接触抑制,植物细胞和动物细胞培养的比较,我们能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？,根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达；把两种动物的优良性状集合在一块儿?,思考：,二 动物体细胞核移植技术 和克隆动物,动物体细胞核移植技术:,将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉 细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新 的胚胎， 这个新的胚胎最终发育成动物个体。
8、用核移植的方法得到的动物称为克隆动物,核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,（难度高）,体细胞核移植的过程：,思考： 1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？ 2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。,取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（M中期）为什么？,激活方法： 激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2.）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营
9、养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,过程,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵母细胞（减中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,电刺激,重组细胞,重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,新个体(与母体相同的个体),讨论,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在
10、体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体DNA是来自于受体卵母细胞。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,应
11、用前景,1、加快家畜遗传改良进程 2、保护频危物种 3、器官移植供体 4、利用生物反应器生产生物蛋白,前景,应用前景,1、加快家畜遗传改良进程 2、保护频危物种 3、器官移植供体 4、利用生物反应器生产生物蛋白,存在问题,成功率低 存在健康问题 克隆动物食品的安全问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体 型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷， 免疫失调等。,小结：,动物细胞工程,动物细胞融合与 单克隆抗体,1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的动物细胞融合成一个细胞的过程。,一、动物细胞融合,2.结果：形成了单核的杂交细胞 3.原理：细胞膜的流性,4、诱导方式：,物理法：离心、振动
12、、电激,化学法：聚乙二醇（PEG),生物法：灭活的病毒,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交细胞。 融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞,动物细胞融合的过程,思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,3、动物细胞融合技术的应用,细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 利用细胞融合技术，制备单克隆
13、抗体。,人们获得抗体的传统方运用法是? 将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么? 产量有限，纯度低，特异性差，反应不够灵敏 运用已学知识，设想怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体？ 每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体 如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体单克隆抗体。 能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？ B淋巴细胞在体外不能无限增殖。,二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备,思考,怎样解决这一问题呢？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？,单克隆
14、抗体的制备- 极富创造性的方案 如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体,米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,培养液中细胞有几种类型？ （只考虑两两融合）融合细胞几种类型？,5种 B淋巴细胞、骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞 B淋巴细胞- B淋巴细胞 B淋巴细胞-骨髓瘤细胞 3种 骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞 B淋巴细胞- B淋巴细胞 B淋巴细胞-骨髓瘤细胞,多种杂交细胞,在具有筛选作用的培养基上培养,专一抗体检验阳性,克隆上述杂交细
15、胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体， 检验阳性细胞,单克隆抗体,注射到小鼠体内,体外培养,1、单克隆抗体的制备过程,第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。,第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,该细胞继承双亲细胞的遗传特性，既能产生专一抗体又能无限增殖。,杂交瘤细胞有何特点？,特异性强，灵敏度高,1.单克隆抗体的制备过程：,特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖,单克隆抗体制备过程,B淋巴细胞 骨髓瘤细胞,诱导融合,B-B细胞,B-瘤细胞,瘤-瘤细胞,选择培养,杂交瘤细胞（ B-瘤细胞）,克隆化培养,抗体检测,产生所需抗体的杂交瘤细胞,体外培养,单克隆抗体,课堂小结,
16、单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？,动物细胞融合技术 动物细胞培养技术,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,特点：特异性强灵敏度高可大量制备,1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点. 2、用于治疗疾病和运载药物： 主要用于癌症治疗。 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）,2、单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3、单克隆抗体的应用,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,
