CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT

上传人:l**** 文档编号:143453992 上传时间:2020-08-29 格式:PPT 页数:51 大小:5.68MB
返回 下载 相关 举报
CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT_第1页
第1页 / 共51页
CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT_第2页
第2页 / 共51页
CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT_第3页
第3页 / 共51页
CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT_第4页
第4页 / 共51页
CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT_第5页
第5页 / 共51页
点击查看更多>>
资源描述

《CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT》由会员分享,可在线阅读,更多相关《CFX96实时荧光定量PCR培训教材PPT(51页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。

1、实时荧光定量PCR原理与应用,Gene Expression Division China Marketing Bio-Rad Laboratories,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,PCR目的及背景,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术,是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便, 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝. 分子克隆, 目的基础检测,遗传病的基因诊断,法医学,考古学等方面得到了广泛的应用。 技术实际上是在模板, 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应,

2、技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分三步:变性(denaturation);退火(annealing);延伸(ex tension),反应过程见图。,传统 PCR,传统 PCR,传统 PCR,通过凝胶电泳对终产物进行定性分析 (30 cycles),传统 PCR,Theoretical increase,Log Target DNA,Cycle #,In theory, PCR reactions amplify exponentially, doubling every cycle and grow forever. In reality,PCR: 理论vs. 实际,100 倍

3、稀释,普通PCR分析终产物特点,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,定量PCR,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析,5,模板,Cycle 1,5,2X 模板,4X模板,30-40 循环,Cycle 2,5,5,荧光检测,F,F,F,F,F,F,F,F,荧光监测化学物质,Log View,Linear View,本底期、指数扩增期、平台期,荧光阈值:在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准) Ct值的定义是PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时(进入指数增长期)所经过的扩增循环次数,荧光阈值与Ct值,定量PCR分析

4、初始模板特点,108,标准曲线,106,108,标准曲线,104,108,106,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,105 copies/well,标准曲线,Ct值特性,ProductT = (Template0)2n (n = # of cycles),ProductT = (Template0)23.32 = (Template0)10,定量PCR优点,定量:对初始模板的绝对定量 优点:更灵敏,宽广的动力学范围 污染机会少:闭管化学 没有后处理:不用杂交、电泳、拍照 操作简单:高

5、度自动化 用途广泛:既能定量又能定性 灵活:既可多点测定,又可单点测定,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,非特异性标记 SYBR Green I Eva Green,荧光化学物质,特异性的荧光探针 TaqMan 分子信标(Molecular beacons),SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,使用方便,只需要一对引物 不必设计复杂的荧光探针 熔解曲线 鉴定PCR有无杂带、引物二聚体 便宜 灵敏 无模板特异性 不能分辨非特异产物 不能做复合PCR扩增,融解曲线反应程序

6、,1、融解曲线在定量PCR反应完成之后,2、软件自动分析结果,生成融解曲线图谱,融解曲线分析-原始图谱,融解曲线分析-导数图谱,EvaGreen 饱和荧光染料,非饱和双链DNA荧光染料:e.g. SYBR GreenI,饱和双链DNA荧光染料:e.g. Eva Green,Saturation Dyes,Dye saturation leaves no room for relocation events during melting,饱和染料特点,饱和型的专用DNA染料 高浓度不抑制PCR反应 当双链DNA局部解链时,游离下来的染料不会重新结合到DNA分子上去,荧光强度的降低精准可靠地反映出

7、DNA分子的解链情况,Eva Green MixBio-Rad,PCR 抑制作用,Source: Barrett et al., Quantace Ltd.,染料重新分配,Source: Barrett et al., Quantace Ltd.,高分辨溶解曲线,High Resolution Melt (HRM) Chemistry DNA binding dyes - LCgreen, EvaGreen and Syto9 (DNA饱和染料,低抑制作用) Hardware Able to resolve 0.1oC increments (仪器在融解过程中更密集地收集数据) Softwar

8、e Algorithm able to separate small difference in Tm(分析算法可以分辨Tm值的微小差异),Just import CFX Melt Data,Automatic selection of Pre- and Post- Melt regions,Normalize curves,Just check normalized plots and apply temperature shift,Automatically detects clusters,Precision Melt - Genotyping,Homozygous - CC,Homoz

9、ygous - TT,Heterozygous - CT,SsoFast EvaGreen & SNP Genotyping,GA Mutation () G:G Wild-type () A:A Homozygous Mutant () G:A Heterozygous,Discrimination of a Class 2 SNP,Methylation Studies CGU (Taipei),Temperature shifted,Difference curve,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,对目标序列有很高的特异

10、性 -特别适合于SNP检测 可以在一个反应中进行两个基因的定量 荧光强度与反应物成正比 反应成本较高 设计复杂,TaqMan探针小结,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,定量PCR应用I-实时定量,病原体定量检测 转基因拷贝数的检测,DNA定量拷贝数研究(替代Southern Blot),RNA定量基因表达差异(替代Northern Blot),单个或多个基因地表达谱分析 不同组织、器官 不同时期 不同处理,定量PCR应用II:终点读板,基因突变分析 单基因遗传病诊断,如血友病、地贫 SNP扫描 疾病相关基因鉴定,如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定 SNP检测与临床表现的相关性,如抗高血压药物疗效的个体差异 药物副反应的预防,如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定各种病毒,细菌,病毒病原体检测,如炭疽菌,E coli. O157,我们的共同目标!,追求人生的美好!,

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 办公文档 > 工作范文

电脑版 |金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号