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1、实时荧光定量PCR原理与应用,Gene Expression Division China Marketing Bio-Rad Laboratories,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,PCR目的及背景,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝. 分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 技术实际上是在模板， 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，
2、技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反应过程见图。,传统 PCR,传统 PCR,传统 PCR,通过凝胶电泳对终产物进行定性分析 (30 cycles),传统 PCR,Theoretical increase,Log Target DNA,Cycle #,In theory, PCR reactions amplify exponentially, doubling every cycle and grow forever. In reality,PCR: 理论vs. 实际,100 倍
3、稀释,普通PCR分析终产物特点,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,定量PCR,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析,5,模板,Cycle 1,5,2X 模板,4X模板,30-40 循环,Cycle 2,5,5,荧光检测,F,F,F,F,F,F,F,F,荧光监测化学物质,Log View,Linear View,本底期、指数扩增期、平台期,荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准) Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数,荧光阈值与Ct值,定量PCR分析
4、初始模板特点,108,标准曲线,106,108,标准曲线,104,108,106,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,105 copies/well,标准曲线,Ct值特性,ProductT = (Template0)2n (n = # of cycles),ProductT = (Template0)23.32 = (Template0)10,定量PCR优点,定量：对初始模板的绝对定量 优点：更灵敏，宽广的动力学范围 污染机会少：闭管化学 没有后处理：不用杂交、电泳、拍照 操作简单：高
5、度自动化 用途广泛：既能定量又能定性 灵活：既可多点测定，又可单点测定,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,非特异性标记 SYBR Green I Eva Green,荧光化学物质,特异性的荧光探针 TaqMan 分子信标(Molecular beacons),SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,使用方便，只需要一对引物 不必设计复杂的荧光探针 熔解曲线 鉴定PCR有无杂带、引物二聚体 便宜 灵敏 无模板特异性 不能分辨非特异产物 不能做复合PCR扩增,融解曲线反应程序
6、,1、融解曲线在定量PCR反应完成之后,2、软件自动分析结果，生成融解曲线图谱,融解曲线分析-原始图谱,融解曲线分析-导数图谱,EvaGreen 饱和荧光染料,非饱和双链DNA荧光染料：e.g. SYBR GreenI,饱和双链DNA荧光染料：e.g. Eva Green,Saturation Dyes,Dye saturation leaves no room for relocation events during melting,饱和染料特点,饱和型的专用DNA染料 高浓度不抑制PCR反应 当双链DNA局部解链时，游离下来的染料不会重新结合到DNA分子上去,荧光强度的降低精准可靠地反映出
7、DNA分子的解链情况,Eva Green MixBio-Rad,PCR 抑制作用,Source: Barrett et al., Quantace Ltd.,染料重新分配,Source: Barrett et al., Quantace Ltd.,高分辨溶解曲线,High Resolution Melt (HRM) Chemistry DNA binding dyes - LCgreen, EvaGreen and Syto9 (DNA饱和染料，低抑制作用) Hardware Able to resolve 0.1oC increments （仪器在融解过程中更密集地收集数据） Softwar
8、e Algorithm able to separate small difference in Tm（分析算法可以分辨Tm值的微小差异）,Just import CFX Melt Data,Automatic selection of Pre- and Post- Melt regions,Normalize curves,Just check normalized plots and apply temperature shift,Automatically detects clusters,Precision Melt - Genotyping,Homozygous - CC,Homoz
9、ygous - TT,Heterozygous - CT,SsoFast EvaGreen & SNP Genotyping,GA Mutation () G:G Wild-type () A:A Homozygous Mutant () G:A Heterozygous,Discrimination of a Class 2 SNP,Methylation Studies CGU (Taipei),Temperature shifted,Difference curve,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,TAQMAN 探针,对目标序列有很高的特异
10、性 -特别适合于SNP检测 可以在一个反应中进行两个基因的定量 荧光强度与反应物成正比 反应成本较高 设计复杂,TaqMan探针小结,提纲,PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用,定量PCR应用I-实时定量,病原体定量检测 转基因拷贝数的检测,DNA定量拷贝数研究（替代Southern Blot）,RNA定量基因表达差异（替代Northern Blot),单个或多个基因地表达谱分析 不同组织、器官 不同时期 不同处理,定量PCR应用II：终点读板,基因突变分析 单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 SNP扫描 疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定 SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异 药物副反应的预防，如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定各种病毒，细菌，病毒病原体检测，如炭疽菌，E coli. O157,我们的共同目标!,追求人生的美好!,
