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1、Western blotting的影响因素（一）：电泳 Western blotting是一个步骤繁多的实验。很多的操作过程，每一步都会对最后的结果产生影响，接下来的这几个帖子我想把我这段时间做Western blotting总结的一些影响实验结果的因素写下来，如果你有更好的建议，希望也能贡献出来，大家一起学习进步。 电泳过程是第一步，也是很重要的一步，好的电泳能让目的条带整齐，就像人工画的。要做好电泳也并非易事，我总结有这些方面的因素能影响电泳效果：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在78之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是
2、否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，具体的影响因素有：1.分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。2.所用丙烯酰胺的纯度和凝胶聚合时间，不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸，它会影响到凝胶内部局部PH环境，因此会影响电泳的效果，没有聚合充分的凝胶会含有游离的丙烯酰胺，也会影响到局部PH环境，它们还会与蛋白上的氨基、巯
3、基以及酚羟基反应影响蛋白的泳动。凝胶聚合时间以分离胶45min，浓缩胶20min为宜。此外，单体放置时间过长也会造成丙烯酸的累积。3.凝胶母液混合是否均匀也会影响到凝胶浓度的分布。4.配备的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也会影响到网孔的大小，因此也会对电泳的质量有影响，一般取（3040）：1，特殊要求的实验也可以灵活变动。5.APS及TEMED的加入量，APS极易潮解而失去活性，因此最好是现用现配，APS不宜加入过多，否则会氧化蛋白样品。TEMED作为加速剂，有利于氧自由基的富集，从而加速聚合反应，因此所用的TEMED尽量不要被氧化（氧化后发黄），还有加入的TEMED也不宜过多或过少，过多
4、会升高PH值并能与蛋白反应，过少则会造成聚合不充分，网孔变大，并且造成游离丙烯酰胺单体的增多，它们也会和蛋白反应以及改变局部PH。6.点样孔底部要平整。3. 点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。还有，加样之前最好先冲洗一下加样孔底部，减少没有聚合的丙烯酰胺的影响。还有，尽量从加样孔的中间点样，这样能使得样品在加样孔中的浓度分布尽量均匀，这也会对最终蛋白条带的形状有影响的。加样量也不能过高或过低，过高会影响条带的形状，过低不利
5、于后面的杂交反应。4. 电泳缓冲液。尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定。5. 电压条件。电压过高，一方面会使凝胶温度上升，改变凝胶内部PH值，甚至会造成溶胶，另一方面，电流过大也不利于蛋白分子的分离，容易造成条带变形，电压过低，又会有样品扩散的影响。我们经常用的浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。6. 其他的因素，如做胶的玻璃板要干净，底下或上面不能有杂质（如铁锈等），加分离胶之前要把上面的有机相洗干净，并尽量吸干水分。胶板加到电泳槽之后检查胶板底部是否有气泡，有的话用枪吹走，这个会严重影响电流方向，进而影响电泳效果。（二）：转膜转膜是对western bolttin
6、g最终结果影响最大的一步，砖模质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45m的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的Western用膜有NC膜、PVDF膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表：name NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背
7、景 低 较高 低 结合能力 80110 ug/cm2 400 ug/cm2 125200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合） 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿 检测方式 常规染色，可用放射性和非放射性检测 不能用阴离子染料 常规染色， 比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。 适用范围 0.45um 一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中) 糖蛋白检测
8、和蛋白质测序 价格 价格较便宜 便宜 较贵 其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。 最后是实验操作方面的问题。使用PVDF膜的时候需要进行预处理，这里面会带来一些问题，如甲醇润湿不够，膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误差。膜上面一定不要有油脂类的东西，否则也会影响蛋白结合和抗体的杂交。(三)：抗体杂交与底物显色Western blot最常用的检测方法就是用一抗和二抗的方法，其它的如用生物素-链霉亲和素或者Protein G/A的方法由于用的比较少，就不在此讨论了。使用一抗和二抗的检测方法是基于信号放大的原理，加大
9、了检测的灵敏度。当然这样做也能减少成本和提高效率，我们只需要优先的几种标记的特异性好的二抗就能满足大量的实验要求。 抗体杂交方面能影响最后实验结果的因素不多。首先是一抗的选择，尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白，一般说明书里标明可以用于WB的都是可以用来做Western的。尽量选择小鼠或者兔来源是考虑到其他实验如果要用这种抗体的话，这两种来源的会增加适用范围。单抗的特异性好，能减少非特异条带。其次是一抗的杂交条件，一般用4过夜为好，当然首先尊重说明书中的建议。再其次就是一抗洗涤的条件，一般采用含0.51.0Tween-20的TBST来洗，5
10、分钟一次，洗3至5次即可，如果遇到背景比较脏的情况，也可以适当提高吐温的含量。二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。抗体的稀释倍数是由显色方法决定的，可以先用说明书建议的稀释条件做一下，再根据结果调整稀释倍数。显影或显色这一步对结果的影响是非常大的。用荧光素、同位素或者生物素标记的不常用，就不讨论了，最常用的是用标记的，常用的标记酶包括辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、半乳糖
11、苷酶-Galactosidase。这些酶类主要有两种检测方法：底物显色和化学发光。HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中。这几种显色底物的各种性能的比较见下表：底物DAB4-CNAECTMB学名 3,3-diaminobe
12、nzidine tetrahydrochloride 4-chloro-1-naphthol 3-amino-9-ethyl carbazol 3,3,5,5tetramethylbenzidine 分子量 214.14 178.58 210.28 240.4 稳定性 好 一般 避光 好 灵敏度 250pg 1ng 100pg 背景 一般 低 高 高 终产物成像性 不能很好的成像 容易成像 容易成像 颜色 褐色 介于蓝色与蓝紫色之间 （可用于double-staining） 棕红色 蓝紫色 毒性 有（疑有治癌作用） 无 有 无 HRP化学发光反应底物可以用琳琅满目来形容。常见的化学发光底物包括
13、Luminol、 GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL系列，还有Pierce公司的SuperSignal系列等。Luminol系列是经典的HRP化学发光底物，但现在发展出来的高效的化学发光底物更受欢迎。ECL在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。GE Healthcare公司后来推出的ECL Plus和ECL Advance不单将检测灵敏度提高了1020倍，发光时间也长达24小时以上。Pierce公司的SuperSignal灵敏度高（有10-12g级，10-14g级，10-15g 级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4至少是12个月），节约抗体。有一点需要注意的是二抗最好不用叠氮化钠做防腐剂，因为叠氮化钠是HRP的抑制剂。
