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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 液相色谱仪基本配置和注意事项 一、 液相色谱仪的基本配置和构成有: 液相泵、 色谱柱、 检测器数据处理、 进 样器、 柱温箱。 二、 液相基本组成 1、 输液泵 2、 进样单元 3、 分离单元 ( 色谱柱) 4、 检测器 三、 常见液相单元的故障及解决 1、 输液泵 2、 手动进样阀 3、 色谱柱 4、 检测器 ( 一) 输液泵的操作 液相色谱输液泵一般由入口单向阀、出口单向阀、注塞杆、 泵密封圈等组成 , 是液相色谱的重要组成部分, 要保持泵的良好操作规程。必须维护系统的清洗, 保证溶剂的纯度 : ( 1) 用高纯度的试剂和 H
2、PLC 级溶剂 ( 2) 过滤流动相和溶剂 ( 3) 脱气 ( 4) 再次使用前放空脱气 , 工作结束从泵中洗去缓冲液( 最好另外清洗柱塞 ) ( 5) 不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中 ( 6) 定期更换泵垫圈 ( 7) 查阅有关泵的操作手册 ( 二) 手动进样阀 1、 正确的进样方式 ( 1) 手动进样阀在INJECT 位置: 把取存试液的进样针导入进样孔, 直到插入 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 为止( 必须穿过转子密封圈聚四氯乙烯套管) ; ( 2) 转动手柄到 load 位置: 把试液放入阀体中的定量环里; ( 3) 同时转动手柄到 INJECT 位置:
3、试液进入液路。 2、 进样前样品处理及注意事项 ( 1) 须用专用平头液相专用注射器进样( 禁用气相尖头进样针 ) ; ( 2) 进样试液应无颗粒、 浑浊和乳化 , 使用前先用超声波溶解后 , 须用 0.45um 的过滤膜过滤 ; ( 3) 部分装取样时 , 取样体积一般小于定管的50%, 完全装液相取样体积取必 须是定量环的 5 倍以上 ( 特别是高要求分析中外标定量) ; ( 4) 如流动相使用缓冲盐 ( 或酸性、 碱性) 在使用结束时必须用蒸溜水在load 和 INJECT 位置重复冲洗干净 , 因盐析出会损害转子、定子密封圈 ; 3、 进样阀故障及维护 ( 1) 在进样针与进样阀不相配
4、 ( 针外径偏小 ) 情况, 能够用铅笔的橡皮头将针 导管压入少许 , 使密封环变小达到严格密封; ( 2) 转子密封圈漏液的维护 : 转子密封圈少量漏液 , 拧松手柄六角螺钉 , 手柄沿轴方向送进 , 使手柄里的 突出部嵌入压力调整螺钉缺口, 旋转手柄 1/20 圈, 直到不漏液为止 ; 转子密封圈损坏 , 经过方法还漏液则需要更换转子密封圈。 拧下三个定子螺钉 , 从主体上卸下转子密封圈, 用手柄拧松压力调整螺钉半圈 ( ) 安装上三个定子螺母均等地牢牢拧紧, 再来调整压力螺丝拧到原来红色 标记位置。 ( 三) 液相色谱柱 1、 正确的使用方法 ( 1) 进样的试样最好称量 , 超声波溶解
5、 , 样品过滤器过滤后进入色谱; ( 2) 在有条件情况下 , 最好一个样品使用一支色谱柱, 可延长柱使用寿命 ; ( 3) 色谱柱在使用后必须冲洗干净后方可保存过夜; ( 4) 对于使用酸、 碱、 缓冲盐的流动相 , 柱子必须用蒸溜水 ( 含 5% 有机溶剂 ) 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 冲洗干净 , 再用甲醇、乙腈冲洗保护 ( 对反相柱 ) 。 2、 色谱柱的维护 ( 1) 流动相所用试剂尽可能是色谱纯试剂, 水最好是超纯水或全玻璃双重蒸溜 水; ( 2) 流动相使用前用溶剂过滤器除去可能存在的微粒, 流动相应现用现配。对 含盐的流液特别应注意长时间会
6、产生细菌或出现沉淀; ( 3) 柱子在使用过程中会产生 : 塔板数下降峰形变差压力增加保留时 间变化。为使柱子使用寿命延长 A 每天使用完后必须当天冲洗干净; B 压力增大时 , 可能是过滤筛板 污染 , 能够将柱头螺母卸下取出滤片并将其在 20% 的硝酸溶液里超声波清洗约15 分钟, 再用纯水超声波清洗10 分钟, 重新 装入色谱柱 ; ( 4) 色谱柱的再生 A. 反相柱分别用甲醇 : 水=90: 10, 纯甲醇 , 二氯甲烷做流动相依次冲洗, 每 次冲洗体积为柱体积的30 倍, 然后以相反顺序冲洗 ; B. 正相柱分别用正己烷 , 异丙醇 , 二氯甲烷 , 甲醇做流动相依次冲洗 , 每次
7、为 柱体积的 30 倍, 甲醇冲洗完以后再以相反的次序冲洗, 至正己烷。 注意使用流 动相必须严格脱水。 ( 四) 紫外检测器 紫外检测器是应用最广泛的检测器, 可测 190-350mm 光吸收变化 , 其结构基本 部件: 氚灯流通值和传感器等等。应注意事项: 1、 氘灯的注意事项 ( 1) 在开动液相色谱仪时最好先开泵, 等流入大致平衡后再开检测器, 能够缩 短氘灯使用时间 , 冲洗关机也一样。先关检测器, 后冲洗 ; ( 2) 在分析中没有较长时间间隔, 能够不关检测器。 2、 流通池检测事项 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 ( 1) 流通池是各分离组分经色
8、谱柱分离到检测器的通道。流通池应定期清洗检 查, 定期更换池垫圈 ; ( 2) 流通池常见故障是产生气泡, 噪音较大 , 流动相必须严格脱气 , 其次在检 测器出口加一较长背压管; ( 3) 不相互溶的溶剂没有中间过渡会产生气泡, 以及噪音变大 , 故必须用异丙 醇过渡后再换上新的溶剂; ( 4) 流通池本身污染程度能够在UV-254nn 处检查 , 样品池和参比池的两处的 光能量结果来判断。 3、 氘灯的更换 ( 1) 必须关闭检测器电源 , 等灯基本冷却后再操作 ; ( 2) 氘灯使用能够经过检查实际使用时间和结合光能量来办; ( 3) 氘灯更换必须戴手套 , 以防污染灯的表面产生噪声。
9、( 4) 灯座位置必须安装到位 4、 流通池的清洗必须按照操作规程来处理 ( 1) 下池入口、出口、 液路路管 ( 2) 用带金属接头的注射器连接池进口端、出口端注入异丙醇。 ( 3) 回抽 10 毫升异丙醇经过池去掉残留流动相。 ( 4) 回抽 10 毫升蒸溜水 ( 5) 回抽 10 毫升 60mol/L , 磷酸经过池去掉沉积物。 ( 6) 回抽 20 毫升蒸溜水 ( 7) 用至少 100 毫升蒸溜水正向经过池入口 液相色谱仪常见故障的检查 液相色谱仪常见故障的检查 液相色谱仪根据当前市场情况, 主要分进口和国产两大类液相色谱仪。进口主要有美国产 Waters 、 安捷伦、赛尔泰、 戴安、
10、 日本岛津等系列液相色谱仪; 国产有大连依利特、大 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列液相色谱仪。各生产厂家 生产的液相色谱仪性能也各有差别。但液相色谱仪主要包括三个系统: 即输液泵、进样器和检测器系统。输液泵系统主要有泵体、吸滤头、入(出)单向阀、柱 塞杆、压力传感器、在线过滤器、排空阀等组成; 进样系统主要阀体、定量环、进样 针等组成 ; 检测器主要由电路系统、光路系统、光源、 检测池等组成。 要分析和判断色谱仪的故障所在, 就必须要熟悉液相色谱工作输液和进样、检测这三大系 统 , 特别是构成这三个系统部件的
11、结构、功能。色谱仪的故障是多种多样的。而且某一故 障产生的原因也是多方面的。 以下是液相色谱仪在使用过程中经常出现的故障现象以及解决方法, 供大家参考和借鉴。 1、 液相泵不输液可能的原因可采用的排除方法 ( 1) 吸滤头堵塞。清洗或更换吸滤头 ( 2) 吸入管连接口漏液、重新安装或更换管路密封螺丝 ( 3) 入口、出口单身阀失灵、用超声波清洗或更换单身阀 ( 4) 泵腔内有气体、用 10ML 注射器抽出其中气体 ( 5) 柱塞杆磨损、更换柱塞杆 ( 6) 泵头漏液、检查泵密封圈或清洗、更换密封圈 2、 系统压力偏高或压力波动大 ( 1) 管路在线过滤片污染1、 清洗在线过滤片或更换 ( 2)
12、 管路堵塞, 重新剪切 , 重新安装 ( 3) 手动进样器堵塞, 检查进样器转子、定子及定量环 , 清洗或更新 ( 4) 保护柱污染, 清洗或更换保护柱芯 ( 5) 色谱柱污染, 清洗或更换 ( 6) 混合器污染 (双泵 ) , 清洗混合器 (内过滤片 )或更换 3、 仪器使用基线漂移较大可能的原因可采用的排除方法 ( 1) 系统流动相未平衡好, 稳定时间长一点 ( 2) 色谱柱使用后期污染, 清洗再生色谱柱或更换 ( 3) 样品没走完 , 清洗管路或液路 ( 4) 检测器污染 , 清洗检测器和检测池。 ( 5) 流动相污染、不纯、未脱气、未过滤 , 使用 HPLC 级试剂 , 充分过滤。 (
13、 6) 系统污染 , 清洗整个流路系统 ( 7) 氘灯能量不足, 更换氘灯 ( 8) 电源 (电压 )不稳定 , 安装稳压电源 ( 9) 室内环境较差, 改进室内环境, 保持一定温度和湿度 ( 10) 系统漏液 , 检查液路 , 确保流路不漏液、不堵塞。 4、 保留时间重现性不好可能的原因可采用的排除方法 ( 1) 样品进样量相差较大, 样品进样量保持一致 ( 2) 系统未平衡 , 系统平衡时间长一点 ( 3) 分析方法不合理, 重新筛选色谱柱或流动相 ( 4) 色谱柱选择不合理或使用后期, 清洗或更换色谱柱 ( 5) 流动相混合不均匀或试剂质量不好, 混合时间长一点, 选择 HPLC 试剂
14、( 6) 系统漏液 , 检查流路 , 确保流路不漏液、不堵塞 5、 测试样品出现分叉峰可能的原因可采用的排除方法 ( 1) 保护柱污染清洗或更换 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 ( 2) 色谱柱污染清洗或更换 ( 3) 进样阀污染清洗或更换 ( 4) 检测器污染清洗检测池、更换垫片或透镜 ( 5) 溶解样品的试剂选择不合理重新选择合适的试剂 问: HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法 答: 1、 样品量不足 : 解决办法为增加样品量 2、 样品末从柱子中流出: 可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 3、 样品与检测器不匹配: 根据样品性质调整波长或改换检测器
15、 4、 检测器衰减太多: 调整衰减即可。 5、 检测器时间常数太大: 解决办法为降低时间参数 6、 检测器池窗污染: 解决办法为清洗池窗。 7、 检测池中有气泡: 解决办法为排气。 8、 记录仪测压范围不当: 调整电压范围即可。 9、 流动相流量不合适: 调整流速即可。 10、 检测器与记录仪超出校正曲线: 解决办法为检查记录仪与检测器, 重作校正曲线。 问: 做 HPLC 分析时 , 柱压不稳定 , 原因何在 ? 如何解决 ? 答: 原因可能有 : 泵内有空气 , 解决的办法是清除泵内空气, 对溶剂进行脱气处理: 1、 比例阀失效 , 更换比例阀即可。 2、 泵密封垫损坏, 更换密封垫即可。
16、 3、 溶剂中的气泡, 解决的办法是对溶剂脱气, 必要时改变脱气方法; 4、 系统检漏 , 找出漏点 , 密封即可。 5、 梯度洗脱 , 这时压力波动是正常的。 现代高效液相色谱中 , 分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择。可是色 谱填料的选择范围很宽, 因此 , 要做合适的选择 , 必须对此有一定的认识和了 解。 一、 硅胶基质填料 1 、 正相色谱正相色谱用的固定相一般为硅胶( Silica) 以及其它具有 极性官能团胺基团 , 如( NH2, APS) 和氰基团 ( CN, CPS) 的键合相填料。 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 由于硅胶表面的硅羟基( SiOH) 或其它极性基团极性较强, 因此 , 分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小, 即极性较弱的组份最先被冲洗出众谱 柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低, 如正已烷 ( Hexane) , 氯仿 ( Chloroform) , 二氯甲烷 ( Methylene Chloride)
