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1、第二章 基因工程载体和工具酶,本章目录,2.1 载体 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.2 工具酶 2.2.1 限制性核酸内切酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5 末端脱氧核苷酸转移酶,第二章 基因工程载体和工具酶,第一节 载体,载体的功能及特征,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,克隆载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的装载能力,具有多种单一的核酸
2、内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点,1. 质粒 plasmid,细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNA 大小：1-200kb 能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系 复制分松弛型和严谨型两种 松弛型：10-200 拷贝（加氯霉素扩增） 严谨型： 1-10 拷贝 有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的,天然质粒,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,质粒的自主复制性： ColE1、pMB1、 pSC101等不同启动子 pMB1质粒DNA复制启动控制 松弛型质粒启动子的突变,质粒的基本特征,2. 质粒的不相容性,任何两种
3、含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。,质粒的基本特征,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因,1) 氨苄青霉素抗性基因 2)四环素抗性基因 3)氯霉素抗性基因 4)卡那霉素和新霉素抗性基因 5）lacZ基因,质粒的基本特征,3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因,1) 氨苄青霉素抗性基因 2)四环素抗性基因 3)氯霉素抗性基因 4)卡那霉素和新霉素抗性基因 5）lacZ基因,Lac Z基因的显色原理：,Lac
4、Z基因表达的蓝白斑菌落,基因工程质粒：Plasmid pBR322,松驰型质粒 Ampr， Tetr 多种限制性酶切位点 全长 4362 bp,Plasmid pBR322结构图,4363bp,pBR322质粒结构来源,Plasmid plink 322,在pBR322基础上改建，增加了一个多接头（polylinker），即增加了多克隆位点。 全长 3.8 kb,Plasmid plink 322,pUC 质粒(University of California),pUC 质粒 是由大肠杆菌 pBR322 质粒 与M13 噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体 pUC 18/pUC 19 全长 26
5、74 bp ，有 Amp 抗性基因，一个复制起点ori。带有lac Z的N端 标记序列；因在复制起点ori区域内缺失 rop 基因（改进的pMB1复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。 宿主菌携带半乳糖苷酶C端序列。重组子菌落是白色，空转化子是蓝色。,Plasmid pUC 18/pUC 19 结构,改建质粒的要求：,尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段； 增加多种酶切位点； 增加标记基因； 提高外源DNA的表达水平； 增加质粒在受体细胞中的拷贝数,转化子的筛选方法,遗传标记筛选（载体与目的基因本身） DNA片段大小检测 核酸分子杂交 目的基因表达
6、产物检测,pBR322 质粒克隆外源基因的过程,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,pBR322,4363 bp,ori,将外源DNA片段插在EcoRI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcr,将外源DNA片段插在BamHI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcs,载体遗传标记检测,显色筛选法,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Apr + X-gal,重组子（Apr + lacZ-）,
7、将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落,DNA片段大小检测,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,用BamHI酶切转化子质粒DNA,电泳观察酶解产物片段：,重组子： 2.7 kb + 4.0 kb,非重组子： 2.7 kb,DNA片段大小检测,全酶解图谱法：,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,用EcoRI酶切转化子质粒DNA,目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb,或者： 1.0 kb + 5.7 kb,用PstI酶切转化子质粒DN
8、A,目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb,或者： 0.8 kb + 5.9 kb,质粒DNA提取的策略,质粒DNA的提取 细菌细胞破碎-碱使染色体DNA变性-离心分离-收集质粒DNA-纯化-保存 真核细胞DNA的提取 研磨使细胞破碎-蛋白酶K去核蛋白-分离蛋白质与DNA-纯化-沉淀-纯度检测,质粒DNA的纯化,RNA酶去RNA SDS-蛋白复合物 蛋白酶K去蛋白质 酚-氯仿抽提 纯化试剂盒 紫外分光光度计测A260与A280值：18 或20,质粒DNA沉淀,二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。 乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为
9、01-025M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。 06倍体积的异丙醇沉淀，-20C半小时。,DNA分离,琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 氯化铯密度梯度离心,DNA浓度检测,琼脂糖凝胶电泳 0.05-0.1g EB-标准DNA浓度比较: 1 ng 紫外分光光度计测A260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 accepted 纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。,EB与D
10、NA,DNA大小测量,凝胶上与标准分子量比较 HindIII 100bp ladder 自己的marker,在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？,DNA浓度 DNA大小 波长 纯度 EB量等有关,DNA电泳结果分析,2. 噬菌体, 噬菌体DNA 是线性双链DNA分子，48.5kb 噬菌体粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。 噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状 基因组三个区域： 左侧：包括外壳蛋白基因，20kb 中间区：18kb 右侧：复制及裂解基因，12kb DNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外
11、源片段,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l - DNA,噬菌体的基因组结构,-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，,不利于重组操作，必须删除至1 - 2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增,加一些单一的酶切位点,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增,加酶位点,-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不
12、同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,(一)插入型载体,在Charon4载体中克隆外源DNA,3. M13单链噬菌体,M13噬菌体的生物学特性： 生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长
13、6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的构建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,DNA测序片段的扩增,4. 柯斯质粒cosmid,1978年由Collins和 Hohn改建 正常的质粒与噬菌体的cos位点构成 有Amp，Tet 抗性基因 Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装,柯斯质粒（co
14、smid）的结构,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为31 - 45 kb,柯斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,柯斯质粒的克隆过程,5.人工微小染色体,YAC, yeast artificial chromosome BAC, bacteria artificial chromos
15、ome PAC, P1 artificial chromosome MAC,mammal cell artificial chromosome Fosmid, F因子 改建 而来,酵母人工染色体（YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350 - 400 kb,YAC的构建,酵母人工染色体的应用,克隆载体的发展历史：,第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片段; 第二代：经过改建的病毒，装载能力kb左右; 第三代：cosmid,装载能力30-40kb; 第四代: YAC, 装载能力1-2 Mb; 第 五代: 新型载体: BAC, PAC, MAC, Fosmid 等,装载能力80-200kb,6.穿梭质粒载体 （shuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,
