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1、第 11章 基因工程,第 1节 基因工程概述 第 2节 基因的分离 第 3节 外源基因导入受体 第 4节 转基因生物的检测与鉴定 第 5节 基因工程的应用,遗传工程（genetic engineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。 核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体。 细胞工程（cell engineering） 基因工程（gene engineering） 酶工程（enzyme engineering） 发酵工程（fermentation engineering）,第 1节 基因工程概述
2、,基因工程（gene engineering） 利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。 基因工程操作的对象是DNA分子，首先把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，然后将重组DNA分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。,第 1节 基因工程概述,目的基因的获 目的基因与载体的连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆 基因表达与产物分离,基因工程的内容,第 1节 基因工程概述,第 2节 基因的分离,一 工具酶 载体 三 基因分离方法,第 2节 基因的分离,一、工具酶 （一）
3、限制性内切核酸酶 (restriction enzymes) 限制性内切核酸酶（限制酶）是细菌中降解外来DNA分子的一类酶。 细菌中限制修饰现象：作用于同一DNA的两种酶分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。通过某些碱基进行甲基化修饰，使得限制酶不能进行切割。而外来的DNA在没有被甲基化，限制酶将其降解。,（一）限制性内切核酸酶,共同的特性： 只切割双链DNA分子，不切单链DNA； 每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性； 需要镁离子激活等。,限制酶可分为3类。 型酶：只有EcoB和EcoK两种，具有催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能。 型酶：在遗传工程中应用最广泛。
4、 有特异识别和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的断裂； 断裂的部位通常不是直接相对的，结果所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接； 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成。 型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。,（一）限制性内切核酸酶,（一）限制性内切核酸酶,通过用相同的限制性内切核酸酶切割形成一个重组DNA分子,（一）限制性内切核酸酶,（二）DNA连接酶（ligase）,在分子克隆中使用的DNA连接酶有两种：大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。 催化DNA中相邻的3 OH和5 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接
5、起来。,（三）反转录酶 （reverse transcriptase）,反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合酶。 反转录酶在遗传工程中的主要用途是以mRNA为模板合成cDNA。,（四） PCR,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 。 PCR反应包括三个步骤： 变性：在94-95使模板DNA的双链变性成单链。 复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60 延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互补链 这三个步骤称为一个循环，PCR
6、反应常有25-35个循环。 PCR.EXE,（四） PCR,PCR产物可以通过电泳检测,琼脂糖电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,二 载体,载体（vector）是将外源基因送入受体细胞的工具。作为载体DNA分子，需要具备： 在宿主细胞中能独立复制，有独立的复制起始位点； 载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，即有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增； 有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞； 分子量小，多拷贝，易于操作。 除了上述特点外，一般还要求载体载荷外源DNA的幅度要宽，具有安全性等。,（一） 质粒,质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一
7、种能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大小1kb200kb。 质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。 一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。 质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为“严谨型”和“松弛型”。“严谨型”质粒在每个细胞中的拷贝数通常13个，而“松弛型” 通常在10个以上，可高达200个拷贝。 一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。,（一） 质粒,pUC18可以克隆比较大的DNA片段，在细胞中产生500个拷贝左右。 有一个多克隆位点，位于大肠杆菌的lacZ基因之内，有利于筛选和分离转化细胞。,筛选的原理是：细菌细胞含有野生质粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚
8、-半乳糖苷酶）的培养基上培养时产生兰色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代谢X-gal，从而产生白色菌斑。,（一） 质粒,（二） 病毒载体, 噬菌体基因组全长48kb。具有粘性末端(cos位点)。中间约1/3的序列为中间基因簇(central gene cluster)，两端为DNA左、右臂。基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代, 而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。,噬菌体,（二） 病毒载体, 噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。,(三 ) 克隆大片段载体,粘粒载体、细菌人工染色体
9、和酵母人工染色体载体等。,粘粒载体（cosmid） 是一类含有cos位点的质粒载体. 兼有噬菌体的高效感染能力和质粒的易于克隆和选择的优点，既能像质粒一样在寄主细胞内复制，又能象DNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。,与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点： 具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制； 有像质粒一样的选择标记； cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在1545 kb之间。 由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建，而噬菌体载体多用于cDNA文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，pJ
10、B8是最常用的粘粒载体之一,粘粒载体,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）, BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。 带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）,酵母人工染色体具有自主复
11、制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。 YAC可以接受1-2Mb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。,三 基因分离方法,基于基因库的分离基因方法 T-DNA标签克隆基因 基于PCR的基因克隆 人工合成基因,1 构建基因文库 基因文库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因文库中分离基因，首先要构建基因文库。只有利用合乎要求的基因文库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。,（一）基于基因
12、文库的分离基因方法,核基因文库 核基因文库(genomic library或genomic bank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。 通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体连接构成重组DNA分子, 选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，BAC或YAC等,（一）基于基因库的分离基因方法,理想的核基因文库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 检测是否包括一个完整的基因组序列的公式： 例:人类基因组3.0
13、x106kb, 以EMBL作载体，插入片段的平均长度为17 kb，p为99%时, 基因库应有8.1x105 个 重组噬菌体。,1. 核基因库,染色体基因库,将基因组的一部分（如一条染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。 果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带，利用微切割技术切割，抽提DNA，构建染色体片段基因库。 在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术将人类染色体分开，构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。 在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳方法，将酵母菌的16条染色体据分开，用于构建染色体库。,cDNA库, 以mRNA为模
14、板，经反转录酶合成互补DNA (cDNA)，构建的基因库, cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基因组的部分基因序列。 构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA 库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因。 通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。,cDNA库,2 筛选基因库,从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。 常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位
15、素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。,将重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与少量培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。 将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，用标记的探针与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。 与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号的位置，找出培养皿中所对应的噬菌斑，培养，制备DNA。,菌斑杂交法筛选噬菌体核基因库,菌落杂交技术寻找目标DNA克隆,从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。,（三）序列测定和分析,限制性酶图谱,一个15kb DNA片段的
16、限制性酶图谱构建 实验过程： 首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及酶的组合酶切DNA。酶切的产物用于琼脂糖凝胶电泳，染色，在紫外灯下可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。,限制性酶图谱,结果分析 从凝胶电泳结果可见，模式就是这个15kb DNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。 将不同DNA用限制性酶消化，产生的多态性，即限制性酶片段长度的多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，用来分析DNA水平的变异程度，进行基因组图谱分析。,限制性酶图谱,（二）T-DNA标签克隆基因,基本原理： 利用T-DNA插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料； 然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列； 用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析 。,T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与
