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1、1,临床PCR技术,2,Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。,一、PCR概述,3,一、PCR概述,（一）PCR概念 PCR （polymerase chain reaction)是一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。 特点 高灵敏度 高特异性 体外进行 快捷,4,PCR的概念,核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶
2、，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化。 应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。,5,PCR概述2000至2013年发表论文1280748篇,6,一、PCR概述,（二）原理 双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成）,不断重复,7,二、实验步骤,（一）核酸提取 1.DNA提取,12000g离心5min,模板,8,二、实验步骤,2.RNA提取,8000g离心1min,RNA模板,8000g离心1min,逆转录 为cDNA,重复洗2次,50ul血清,9,3、细胞或组织,模板,加样扩增,杂交显色,
3、10,（二）扩增,HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC 下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG 扩增体系：（50l体系） 10*Buffer -5l dNTP -1l MgCl2 -3l Primer F -2l Primer R -2l DNA -2l Taq酶 -1l H2O -34l,11,反应程序 预变性 94C 3min 循环 延伸 72C 5min。 注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板,30循环,12,（三）结果判读,13,（四）PCR的常见问题及处理措施,常见问题 污染：表现为阴性对照同样出现目的条带或阴性对照出现S形
4、曲线。 污染的来源： 来自其他测试样品的DNA 来自试验材料如重组克隆的DNA外源DNA污染 来自同一靶序列前一次PCR的扩增产物。,14,（三）PCR的常见问题及处理措施,如何减少污染 实验室分区,15,酶法控制 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG) 短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染。 紫外线表面照射 消除试剂、加样头中的DNA污染。 对短PCR产物效果不好 以预防污染为主 良好的实验室操作,16,三、荧光定量PCR,17,（一）荧光PCR定量的概念,以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对PCR起始模板量的定量。,18,（二）荧光定量PCR原理,染料染色
5、 SYBR Green I 溴乙锭(Ethidium Bromide) 探针标记 TaqManTM 分子信标(Molecular beacons),19,TaqMan探针,20,（三）定量PCR的数学原理,PCR 理 论 方 程,N = N0 x (1+E)n,N:扩增数量 N0:起始模板数量 E：扩增效率 n:循环数,21,指数期PCR定量方程才有效,22,PCR曲线,线性图谱,半对数图谱,23,起点定量与终点定量,起点定量,终点定量,“加进不同拷贝的膜板”,24,同一个样品重复96次,起点定量的优势,终点产物数量： 误差太大,拐点产物数量：重现性好,起始DNA量，更具意义 重现性好，误差小
6、,25,起点定量的关键：CT值,CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过 阈值线)时的循环次数,CT值,半对数图谱,CT值,线性图谱,26,CT 起始DNA浓度,当循环次数n=CT值时：,RT = RB + X0 (1+ E)CT Rs lg (RT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg Rs CT lg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT - RB) lg Rs,即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）,Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs,27,CT值 - X0 作图,CT,X0,CT = - k logX0 + b,
7、28,四、PCR检测的临床应用,（一）标本采集要求,29,30,31,（二）结果分析、报告及解释 1.定性PCR与定量PCR的比较 2.定量PCR测定的临床意义 3.定性PCR测定的临床意义 4.定性和定量测定的结果报告及解释,32,1.定性PCR与定量PCR的比较,33,琼脂糖凝胶电泳,34,定量PCR扩增曲线图,35,2.定量PCR的临床意义,对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 对治疗过程进行药物疗效监测 用于基因表达方面的研究,36,某患者HBV-DNA的PCR结果动态图,37,3、定性测定的临床应用 诊断 用于筛检 耐药突变检测 病毒基因型检测,GG AG GG AG AA AA,38,4.定性和定量测定的结果报告及解释,（1）定性 阴性 阳性 （2）定量(以我科参考值为例) HBV-DNA100 IU/ml(不同项目数值不同) 大于参考值，在检测范围之内，是多少报多少。,39,大于107拷贝/ml，日常生活接触强传染性。 小于105拷贝/ml，日常生活接触传染性较小 但不管HBV-DNA的浓度为多少，哪怕是低于检测下限，也均会引起输血后的感染。,（3）血浆HBV-DNA浓度与传染性强弱的问题,40,谢 谢,
