《伤寒杆菌实验室诊断》由会员分享，可在线阅读，更多相关《伤寒杆菌实验室诊断（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、伤寒杆菌实验室诊断研究进展来源：中国论文下载中心 07-12-24 11:56:00 作者：黄永亮 编辑：studa20【关键词】 伤寒杆菌；检测方法；实验室诊断伤寒是由伤寒杆菌引起的肠道传染病，除引起肠道病变外，还能导致其他器官或全身感染，严重威胁人民的健康。伤寒杆菌的诊断依据主要为临床症状及实验室诊断。肥达试验和细菌培养是诊断伤寒杆菌的传统方法，但敏感性低且费时。近年来出现的免疫学检测方法和聚合酶链反应技术具有较高的特异性和敏感性，且操作简单、快速。本文就伤寒杆菌实验室诊断方法综述如下。1 细菌培养培养是最常用确诊伤寒的诊断依据，由于特异性高，不出现假阳性而被称为金标准。血液和骨髓穿剌液先
2、用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行增菌培养，粪、尿可直接接种于 SS 培养基，经历 37 24 h 培养后从 SS 培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，首先进行革兰染色镜检，镜下为革兰染色阴性，呈短杆状，无芽胞，无荚膜。挑选可疑菌落，接种双糖铁，作血清学鉴定为沙门菌属 D 组后，进一步作生化反应，即伤寒杆菌不分解乳糖、蔗糖及鼠李糖，能分解葡萄糖，产酸不产气，赖氨酸脱羧酶阳性，谷氨酸脱羧酶阴性，甲基红试验阳性。副伤寒杆菌形态与伤寒杆菌相似，能分解葡萄糖，产酸产气。临床上伤寒患者在体温上升阶段，在抗生素应用之前作血培养，阳性率可在 80%以上，在发病第 2 周、第 3 周，粪便培养阳性率可达到 60%。培
3、养结果容易受抗生素、培养条件、标本采集的质、量和时间等多因素影响，带菌者检出率较低，结果报告也常需 3 d5 d 的时间。2 血清学反应肥达试验是常用于辅助诊断伤寒的传统方法。其原理是用伤寒杆菌的菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体。伤寒病发作后，约在第 5 天出现 O 抗体，第 10 天第 12 天产生 H 抗体。早期肥达试验需要急性期和大约间隔 10 天的康复期血清，两份标本之间抗 O 抗体或抗 H 抗体滴度升高 4 倍，更有诊断意义。伤寒杆菌的 O 抗原与 A 群、B 群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副
4、伤寒杆菌有一定的交叉反应，因此，肥达反应诊断伤寒杆菌常出现假阳性，特异性差，敏感性低，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要 20 h 以上。3 免疫学方法3.1 酶联免疫吸咐试验(ELISA) 根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。3.1.1 双抗体夹心 ELISA 法 检测的是血清中的伤寒杆菌或伤寒杆菌抗原。其原理是：用于包被的抗体和酶标记的抗体是针对伤寒杆菌鞭毛抗原（H 抗原）的单克隆抗体。与甲、乙、丙型
5、副伤寒杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等无交叉反应，但伤寒杆菌 H 抗原仅有的第一相（d），与斯坦利等一些罕见的沙门氏菌有相同的相位，斯坦利菌虽然不引起类似伤寒的疾病，但可使结果出现假阳性；据文献报道有少数健康人血清也能使双抗体夹心法的结果呈阳性1。因此，ELISA 法特异性有一定的局限性，阳性结果表明有伤寒杆菌或伤寒抗原存在的可能性，但此法敏感性高，阴性结果可靠。该方法操作简便,约 40 min 即能报告结果，具有早期诊断价值，适用于疾病预防部门对从业人员定期检测伤寒杆菌带菌者，追踪传染源，在流行病学上有重要意义。3.1.2 斑点酶联免疫吸附试验（DotELISA
6、 ） DotELI SA 的基本原理是双抗原夹心法。伤寒杆菌的脂多糖（LPS）即 O 抗原能剌激机体产生 IgM 抗体，H 抗原能刺激机体产生 IgG 抗体。通过检测患者血清中的 IgM、IgG 抗体，即可知道是否感染了伤寒杆菌。CardonaCastro2等以硝酸纤维素膜为载体，用伤寒杆菌的 IgG、IgM 抗原包被，利用微孔滤膜的可过滤性使抗原抗体发生反应，建立 DotELISA 试验。对 102 例伤寒患者在发病不同的时间段进行检测，结果显示，IgG 抗体的敏感性和和特异性分别为 88%和88%， IgM 抗体的敏感性和特异性分别为 12.1%和 97%。Khan3等用 DotELISA
7、 法对 128 例疑似伤寒患者进行检测，以骨髓培养为金标准，DotELISA 法的敏感性和特异性分别为 71%和 43%。文献报道 DotELISA 法的敏感性和特异性的差异较大，可能与研究者研究的对象和 IgM、IgG 抗体在患者体内产生的时间有关。3.2 浸染试验（Dipstick assay） 又称快速试纸法。Dipstick 是近年发展起来的一种用胶体金作指示剂的快速诊断方法。基本原理是先将特异性的抗原或单克隆抗体固定于试纸条（硝酸纤维薄膜）的一端，检测时将试纸条的另一端浸入待测样品，由于毛细管作用，样品液向前移动，如待测样品中含有相应的抗体或抗原，则当样品液移至固定有抗原或抗体区时会
8、发生特异性结合，在显色系统的作用下，该区域出现一定的颜色。此法具有操作简单，不需任何仪器，20 min 即能报告结果，适合现场查病时使用。Dipstick 试条上的固相用伤寒杆菌的 IgM 抗原包被，以胶体金作指示标记，检测血清中伤寒杆菌的 IgM 抗体。Tharwat4等用伤寒 Dipstick 纸片法、培养法和肥达反应同时对 30 例经实验室诊断为伤寒的患者进行检测，结果浸染试验在特异性、敏感性、简单、快速方面优于常规方法。4 聚合酶链反应（PCR）PCR 是一种体外 DNA 扩增技术。其基本原理是酶促 DNA 合成反应，即在模板 DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及 DNA 聚合酶的作用下，
9、使 DNA 链扩增。由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展，对伤寒杆菌的基因结构已经清楚，1989 年 Frankel5等发现伤寒杆菌鞭毛蛋白存在着独立的超变基因区域，这个基因区域的核苷酸系列，能把伤寒杆菌与其他沙门氏菌区别开来。根据伤寒杆菌特异基因序列，设计引物，进行 PCR 检测，是现阶段检测伤寒杆菌的最快速准确的方法。4.1 套式聚合酶链反应（NestedPCR ） NestedPCR 又称二次 PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮 PCR，然后再使用第一对引物扩增的 DNA 序列内部的一对引物再次扩增。Kumar6等根据伤寒杆菌鞭毛基因多变区核苷酸系列
10、设计一对外引物：5ACTGCDAAAACCACTACT3（位点：10721089 ）、5TTAACGCAGTAAAGAGAG3 （位点：15131530 ）进行第一轮 PCR，扩增出其中的的特异性片段为 458bp。然后再使用第一对引物扩增的 DNA 序列内部的一对引物：5AGATGGTACTGGCGTTGCTC3（位点： 10921111）、5TGGAGACTTCGGTCCCGTAG3 （位点：14161435 ）再次扩增，扩增出其中的的特异性片段为 343bp。他们对 40 例临床上疑似伤寒的患者，采血进行 NestedPCR 检测及血液培养，同时，在相同条件下对 20 例非伤寒杆菌的血标
11、本进行 PCR 检测和培养。结果血培养阳性的 20 例中，PCR 亦全部阳性；血培养阴性的 20 例中，PCR 呈阳性12 例；非伤寒杆菌对照组 PCR 及培养均呈阴性。其特异性（100%）和敏感性（100%）明显高于传统（血、骨髓）培养法，并且敏感性不受预先抗菌治疗的影响，整个实验在 10 h12 h 内完成 。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少后扩增产物的污染问题极为有用，但也增加了每次试验的复杂性。4.2 一次 PCR 只设计一对引物用于 PCR 即完成检测。Massi7等根据伤寒杆菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物（ 5
12、ACTGCDAAAACCACTACT3、5TGGAGACTTCGGTCGCGTCGT3 ），扩增产物为 367bp 的碱基对。在这个实验中，他们对 6株伤寒杆菌和 8 株非伤寒杆菌同时进行 PCR 扩增，结果只有 6 株伤寒杆菌出现 367bp 的特异性扩增区带，其他 8 株非伤寒杆菌均未出现 367bp 的扩增区带。他们对 73 例疑似伤寒的患者采用 PCR、血培养和肥达试验同时检测，结果阳性率分别为 63%、13.7%和 35.6%。采用一次 PCR 比 NestedPCR 省时省力又降低成本。但一次 PCR 检测临床血标本容易受到血中大量存在的外周单个核细胞 DNA 非特异性扩增的影响而
13、使敏感性降低。4.3 多重 PCR 多重 PCR 是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的 PCR。由于伤寒杆菌有多种不同的抗原基因，只针对鞭毛抗原基因的单一 PCR，有时会漏检。多重 PCR 能全方位高效率地检测伤寒杆菌。Kumar8等针对伤寒杆菌的侵袭基因（invA）、O抗原基因（prt）、H 抗原基因（fliCd ）和表面抗原基因（ViaB）设计不同的引物，在同一 PCR 反应体系内同时扩增invA、viaB、fliCd and prt 基因，以培养法为金标准，对 25 份水样和伤寒杆菌阳性对照进行检测，结果显示，25 份水样均未检出伤寒杆菌，阳性对照最低检测量牛奶和水标本分别为 4
14、.8 cfu/ml 和 2.0 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。与其他常规方法相比，多重 PCR灵敏性更高，结果更准确、可靠。4.4 免疫磁珠分离 PCR（IMSPCR ） 免疫磁珠（immunomagnetic bead, IMB）就是将直径 0.05 l4 l 具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。被检测样品在磁板背景下与 IMB 混合，若有相应的抗原存在，IMB 就会将其捕获，利用磁性将 IMB 聚集，然后进行分离，用于 PCR 测定。Kumar 9等用伤寒杆菌抗鞭毛多克隆抗体包被环氧超顺磁珠，人工配制含伤寒杆菌不同浓度
15、的食物和水标本，然后再采用 IMB 对标本中的伤寒杆菌进行 IMS，用于下一步的PCR 检测。他们根据伤寒杆菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物（5 TGGGCGACGATTTCTATGCC3、5TTTGCGGAACCTGGTTGGCC3 ），预期的扩增产物为 489bp。对 5 份肉类、5 份牛奶、5 份蔬菜、5 份水样等标本进行 IMSPCR 检测，同时用常规 PCR 平行检测。结果显示伤寒杆菌最低检出量分别为 2105 cfu/ml、15105 cfu/ml、15103 cfu/ml 、2103 cfu/ml，与常规 PCR 检测结果相符。这个试验中，检测伤寒杆菌的敏感性较差，特别是牛奶，可
16、能与牛奶的脂质微粒和其他干扰因素多有关。IMSPCR 技术最突出的优点是特异性强，可以明显提高准确性，仅用 6 h 就能完成检测结果。4.5 实时荧光定量 PCR（Real time PCR） 常规 PCR 检测需要从反应体系中吸取产物作模板 DNA 进行签定，转移过程中容易受外源 DNA 的污染，并随样品中待检 DNA 一起扩增，造成假阳性。最近发展起来的 Realtime PCR 技术是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，借助荧光信号检测扩增产物，利用荧光信号的累积来实时监测整个 PCR 的进程。 Massi10等针对从血标本分离出的伤寒杆菌鞭毛蛋白基因，设计引物和 TaqMan 探针系列，对 55 份疑似伤寒患者的血标本进行检测。结果显示，其中 8 例培养阳性的血标本，每毫升血中伤寒杆菌的浓度范围为 1.01103 cfu4.35104
