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1、1,建立分析方法,2,色谱分离度与分离性能,3,HPLC分离的机理,4,色谱工作者关心的基本问题 - 色谱峰之间的分离度,to,tRA,mAU,time,tRB,R = 分离度 tRA = 组分A的保留时间 tRB= 组分B的保留时间 w = 峰的基线宽度 w1/2=半峰宽,5,分离度值,6,等梯度洗脱的基本分离度公式,7,影响分离度的因素,8,容量因子对分离度的影响,9,容量因子 - 流动相组成的影响,10,选择性,11,影响选择性的参数,有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的固定相,12,色谱柱温度对分离度的影响,13,柱效,14,计算柱效,15,典型的流速值,柱内径 mm(5um 粒度
2、),mL/min,16,柱外体积的影响,Time, min.,2.1 x 150 mm F = 0.2 mL / min.,17,所需分离度与柱长匹配,18,峰对称性,19,提高分离度,20,分离度与 k, n 和 的关系,21,液相色谱流动相及固定相,22,流动相,与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。 1、 理想的溶剂应有下列特性 1）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应 2）必须和检测器相适应 使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长 使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别,23,
3、3）对待测物具一定极性和选择性 4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂 5）适宜的粘度 粘度过高，柱压增加 过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡,24,2、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。,25,3、流动相的选择 4、梯度洗脱 特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移,26,固定相,化学键合固定相 方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填（约有3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行） 特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗 分离机理：
4、兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,27,载体主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为： 可以制备成粒度分布窄的多种粒度 机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床 长期高压操作下不变形 反压较低、柱寿命长 较其它材料制成的柱有更高的柱效 适用于小分子、大分子的分析和制备 高pH值下会分解（pH8）,28,键合方法： （l）硅酯化（Si-O-R）键合固定相 （2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相 （3）硅烷化（ Si-O-Si-R）键合固定相 使用键合固定相应注意的问题 硅胶键合相的稳定性 键合相色谱分离的重现性 键合相色谱分
5、离的选择性 键合相色谱柱的再生,29,化学键合相色谱法,30,正相色谱和反相色谱,反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性 正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性,31,正相色谱和反相色谱,正相色谱和反相色谱的差别：,32,33,正相键合相色谱法,固定相：正相色谱中采用极性键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具
6、有胺基、腈基、醚基的极性固定相。,34,流动相： 在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。 主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,35,反相键合相色谱法,采用非极性键合固定相,是把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后,和含有烷基链或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基(或苯基)的非极性固定相，如C18、C8,36,流动相： 流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物 若采
7、用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点,37,硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响,38,分析方法建立,39,分析时要了解的情况,想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA- 仪器制造商的文献 充分了解自己的样品 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法,40,分析时要了解的情况（续1）,灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对
8、分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,41,分离(制备)时要了解的情况,要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?,42,什么化合物参数能用于分离 ?,分子量不同/MW 2000 凝胶渗透 / 凝胶过滤离子化分子 离子对/ 离子交换 极性不同 吸附/ 反相色谱 同系物 / 苯系物 反相 中性、酸和碱的混合物反相 生物分子 亲和/HIC/凝胶过滤/反相 立体异构体 吸附 手性化合物 手性色谱,结构数据,数据收集,43,一般的具体步骤,先用一根
9、短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k 值改变保留值 调节值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度,记住,每次改变一个参数,44,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）,45,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速,46,常规样品分离的系统方法,47,总的指导原则,改变可以明显改善选择性的条件 避免会影响方法普适性的实际问题 减少必要的实
10、验次数，尽可能地利用计算机模拟 选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的HPLC分析方法 先做简单易行的 实验（改变色谱柱、改变pH、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）,48,反相HPLC分离的总体方案设计,1、确定样品是属于常规的还是特殊的 特殊样品包括： 无机离子 对映体 生物分子 合成的高分子 碳水化合物 异构体,49,2、选择分离条件，进行第一次分离,50,选择流动相 在反相色谱中常用水/乙腈 pH的选择思路 选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性 低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小 初期应避
11、免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂,准备标准样品 过滤样品 安装色谱柱 冲洗柱，平衡 平衡检测器 进样 分析结果,51,选择逐步方法开发步骤 用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度 尝试运行梯度,52,无峰/响应,分离度差的峰,第一次运行得到的结果可能:,检测方法不正确 浓度太稀,提高进样浓度，或者在无色 谱柱的条件下注射少量样品,改变流动相,优化系统,得到了色谱峰 - 是 - 否,检查 HPLC系统,53,3、做初次运行并根据谱图将样品分类 0.5k20 等度洗脱可行，超出此范围,等度洗脱可行的样品,建议用梯度洗脱的样品,54,反相保留太弱的样品 改变pH、加入离子对试剂、改变柱
12、子、改用正相色谱,强保留样品 用非水反相或正相条件,复杂样品,55,4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B% 5、评价第二次运行中峰的质量-柱效、峰宽、峰形 峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等） 运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间,56,6、 对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度 若有必要， ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH% 可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化 7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件,57,8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰
13、间距和分离度 结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型 分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件 9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间 10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间,58,等度分离方法,59,反相色谱的方法开发,开发过程实例 色谱条件 色谱柱：C18，4.6mm15cm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 （或走梯度） 流速：1ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl
14、 Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),60,改变容量因子 K,(改变比例), 对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯,通过改变流动相比例改变选择性,61,改变选择性,通过改变流动相组成改变选择性 同样强度的不同溶剂,62,固定相优化：改变色谱柱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,1,2,4,5,6,7,8,9,10,3,C-18,C-8,63,10种巴比妥药物的分离（等梯度）,64,优化流动相 - 困难的分离,1.从甲醇/水开始，优化溶剂组成以使所有色谱峰在合理的 k 范围流出. 2.选择洗脱强度相等的乙腈/水混合流动相进行下一次分析. 3.
15、用四氢呋喃/水流动相重复分析4.按比例混合等强度流动相再进行进样分析,65,三种流动相的比较,洗脱顺序,选择性,66,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性,67,离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8内,68,如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子
16、交换色谱 使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”,69,分离弱离子化化合物的初始实验条件,水相缓冲液 /乙腈 可变 (k = 0.520),分离变量,初始选择,尺寸 粒度 键合相,15 (或 25) x 0.46 cm 5 或 3.5 m C18 或 C8,溶剂 A 和 B（% B）,温度,体积 质量,40C,20 L 25 g,色谱柱,流动相,样品量,流速,1 - 2 mL / min,添加剂,需要时，25 - 50 Mm 三乙胺,缓冲液,25 mM 磷酸钾, pH 3,70,缓冲液,缓冲液 pKa缓冲范围 缓冲液 pKa 缓冲范围 磷酸 甲酸 3.8 2.84.8 pK1 2.1 1.13.1 乙酸 4.8 3.85.8 pK2 7.2 6.28
