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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 曾慧慧部分 氧化还原体系及其抗氧化评价方法和技术 ( 一) 背景知识 1. 现代生物技术的核心技术: 生物大分子的分离、检测、 制备和改造技术 2. 生物体内氧化还原系统 : NADH/FADH2系统、 谷胱甘肽过氧化酶系统、硫氧还蛋白 / 硫氧还蛋白还原酶系统 3. 氧化性损伤及相关疾病 脂质氧化性损伤 : 病毒、 细菌毒素、 动物毒素损伤 ; 膜流动性 ( 微环境 ) 改变、 膜穿孔 及破损 痛风病、 脑缺氧、缺血损伤、癌细胞 膜损伤标志 : 膜流动性下降 ( 饱和脂肪酸多 , 流动性下降 ; 过氧化产物MDA交链, 流动 性
2、下降 ) 膜损伤是某些疾病的早期标志 膜流动性评价 : 直接法 : 粘度变化测定、自旋标记法 间接法 : RBC 膜丙二醛 ( MDA) 含量测定 脂蛋白氧化性损伤 : 脂蛋白及其分类 : 电泳法 : 乳糜微粒 ( CM) 、 前 -脂蛋白 ( VLDL) 、 -脂蛋白 (LDL、 IDL) 、 - 脂蛋白 ( HDL) 超速离心法 : 乳糜微粒、 极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋 白 脂蛋白构成 : CM 主要转运 TG 、 TC, 诱发胰腺炎 ; VLDL主要转运内源性 TG( 一半以上 ) , 冠 心病; IDLTC上升, 动粥; LDL主要内源性 TC, 动粥; Lp( a)
3、类似于 LDL, 动 粥独立因素或冠心病 ; HDL 主要逆向转运 TC, 抗 LDL氧化 LDL氧化性修饰和心血管病 脂蛋白分离方法 : 电泳法、超速离心法 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 DNA 氧化性损伤 : 肿瘤 损伤因素 : Ca 离子、 脂质过氧化、羟自由基、光照、 氧应激 ( 二) 生化分离技术 1. 生化分离技术内容 : 生物组织与细胞的破碎 提取 / 萃取和沉淀分离技术 过滤与膜分离技术 层析分离技术 离心分离技术 电泳分离技术 生物原料的选择和预处理 注意有效成分的含量 , 包括品种选择、器官选择和生长期选择等 保存生物材料的方法包括速冻和有
4、机脱水等 纯化前预处理 : 除去结缔组织哪个非活性部分; -20 保存 ; 有机溶剂去水以延长保存时间; 植物叶片洗净、种子泡胀或粉碎等 2. 生物组织与细胞破碎 组织破碎 : 磨切法 : 匀浆法 / 高速组织捣碎机 细胞破碎的需要 : 制备生物膜制剂、胞内物质的获取 细胞破碎方法 : 原则: 不影响酶活性 机械破碎法 : 研磨法 : 较温和 , 适宜实验室使用。研钵和研棒或匀浆器, 可加石英砂 组织捣碎器法 : 保持低温 , 时间不宜太长。捣碎器 , 可加石英砂 ; 组织匀浆器 压力匀浆法和冻融法 : 用于破碎培养细胞株和淋巴细胞 物理破碎法 : 温度差破碎法 : 置低温冰冻 , 取出迅速融
5、化 , 重复多次 压力差破碎法 : 气穴作用 , 高压释放 , 用于破碎培养细胞株和淋巴细胞 超声波破碎法 : 注意温度和时间 , 多用于微生物细胞 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 化学破碎法 : 常见试剂 : 甲苯、 丙酮、 氯仿等脂溶性有机溶剂或Triton 、 Tween等非离 子表面活性剂 原理: 脂溶性溶剂或表面活性剂将细胞壁细胞膜的结构部分溶解, 进而使细 胞释放出各种酶类等物质, 并导致整个细胞破碎。低温进行防止酶变性 失活 酶促破碎法 : 自溶法 : 利用细胞本身酶系 , 取决于温度、 pH 值和离子强度。需加少量防 腐剂 外加酶 : 降解细菌细
6、胞壁随之因渗透压差引起细胞膜破裂( 注意点 : 低渗或等 渗介质中进行 , 减少细胞器损伤 ) 3. 提取 利用一种溶剂对不同物质溶解度差异, 从混合物中分离一种或几种组分的过程称为提取/ 萃 取或抽提 抽提液条件 : 对有效成分溶解度大 , 破坏作用晓 ; 对杂质不溶解或溶解度很小; 来源广泛、 价格低廉、操作安全。 影响因子 ( 影响溶解度的因素 ) : 离子强度 ( 盐溶盐析 ) 、 PH 值( 偏离等电点 ) 、 温度 ( 0-10) 、 去垢剂 ( 中性去垢剂 ) 、 变性剂 ( SDS 、 尿 素: 溶解剂 ; TCA、 PCA: 沉淀剂 ) 提取方法 : 固液萃取 : 提高破碎程
7、度、进行搅拌、延长时间、提高温度、减少粘度 液液萃取 : 二相溶剂 保护措施 : 采用缓冲体系 : Tris缓冲、 磷酸缓冲体系等 添加保护剂 : 添加某些还原剂 , 如巯基试剂及二硫丁醇类化合物; 金属螯合剂 , 如 EDTA 抑制水解酶 : EDTA- 抑制水解酶 Dnase( 金属离子激活 ) ; 热提法 ; 调节 pH; 加入 抑制剂 ( SDS、 蛋白酶 K-提取 RNA 时; 甲基磺酰氟化物、碘乙酸 -提取蛋 白酶时 ) 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 4. 分离纯化 粗分离 : 沉淀、 离心分离 纯化: 层析、 电泳 分离纯化技术 : 膜分离技术
8、( 过滤/ 透析/ 电渗析 , 按分子大小 ) 、 层析法 ( 极性) 、 电泳 法( 电性) 、 离心技术 ( 分子大小 ) 纯化方法选择 : 1 低分辨力到高分辨力 ( 萃取沉淀吸附等 ) 2 采取高分辨力方 法 层析技术 吸附层析 : 利用吸附层析介质表面的活性基团或活性分子对流动相不同组分吸附性 能差异进行分离的方法 分配层析 : 利用待分离的不同组分在流动相和固定相之间分配系数不同而进行分离 的方法 离子交换层析 : 利用化学键合在固定相表面的具有交换能力的离子基团与流动相到 分离组分的离子可逆结合能力的差异进行分离的方法 亲和层析 : 利用固相载体表面偶联的具有特殊亲和能力的配基对
9、流动相中溶质分子 发生可逆的特异性结合作用而进行分离的方法 凝胶层析 : 利用凝胶层析介质中一定大小的网孔, 对相对分子质量不同的组分阻滞 程度不同而进行分离的层析方法 离心分离技术 : ( 常速、 低速和高速 ) 方法: 差速离心 : 采用不同的离心速度和离心时间, 使沉降速度不同的颗粒分批分 离的方法。需重新悬浮和再离心若干次。 分离大小和密度差异较大 的颗粒 密度梯度离心 : 样品在密度梯度介质中离心, 使密度不同的组分得以分离的 方法。加入一定的梯度介质, 如蔗糖、甘油等 , 常见蔗糖 密度梯度系统。分离沉降系数很接近的物质。切割法、虹 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系
10、改正或者删除。 吸法、 穿刺法收集 等密度离心 : 铯盐在离心场中沉降形成密度梯度, 样品中不同浮力密度的颗 粒在各自的等密度点位置上形成区带。 分离效果较密度梯度离心好 离心条件的确定 : 离心力、离心时间、温度( 4 左右 , 采用冷冻系统 ) 、 pH 值 ( 酶稳定的 pH范围, 必要时可采用缓冲液 ) 超速离心的应用 : 分子量的测定 , Svedberg公式: M=RTs/D(1-v ) 从密度推算 DNA 的 G-C碱基含量 G-C( mol%) =(-1.660)/0.098*100 检测生物大分子中构象的变化 ( 三)ROS与氧化性损伤 1. 自由基 : 具有未成对电子的原子
11、或原子团。活性氧自由基: O2 -. 、 . O2、 . OH 、 NO . 衍生物 : H2O2、 ONOO- 2. 自由基的利用 : 在酶促反应中的作用 : DNA 修复碱基被氧化和DNA 双螺旋断裂可经过酶促反应进行修饰 参与合成某些重要的生物活性物质: ATP、 cGMP 、 cAMP 、 PG 杀灭病原微生物 : a 多形核白细胞 b 中性粒细胞 c 嗜酸粒细胞 杀伤癌细胞 : a粒细胞 b 巨噬细胞 c 天然杀伤细胞 3. 自由基的危害 对核酸和染色体的破坏 : 碱基修饰、链断裂、染色体变异 对蛋白质和酶的破坏 : 蛋白质变性 ( 修饰蛋白质活性、加速变形蛋白质降解 ) 影响酶活性
12、 ( 自由基链式反应使酶分子聚合、酶分子交链、 破坏氨基 酸影响其活性、与酶中金属离子反应影响活性) 对脂质和细胞膜的破坏 : 脂质过氧化产物 : LOOH、 LO -、 LOO- 4. 生物体内自由基的清除剂和抗氧化剂 抗氧化剂 (antioxident): 能够阻止自由基链锁反应启动和蔓延, 终止自由基反应过程的物 质 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 自由基清除剂 (scavenger): 能与自由基反应而除去自由基的物质 生物酶系统 : SOD: 超氧化物歧化酶 , 清除 O2 -. , 胞浆与线粒体中较高 Catalase: 过氧化氢酶 , 清除 H2O
13、2, 存在于过氧化体中 谷胱甘肽过氧化酶 ( GSH-PX) : 清除 H2O2及脂质过氧化物 , 存在于线粒体及胞 浆中 谷胱甘肽转硫酶 : 清除脂质过氧化物 抗氧化剂 : VE 、 VC、 GSH 、 尿酸、 血浆铜蓝蛋白、胡萝卜素与 NADH 5. 自由基 - 抗氧化剂评价 二苯代苦味酰基自由基测定法( DPPH) 用于抗氧化剂的筛选研究 化学法 : 测定天然产物的好方法。 DPPH 有个单电子在 517nm处有一个强吸收 , 其乙醇水溶 液呈深紫色。与抗氧剂结合则吸收消失 电子自旋 / 顺磁共振法 : 检测顺磁物质唯一直接方法。利用ESR波谱定量与定性分析、自 旋捕集法、低温 ESR法
14、 6. 超过氧化物自由基测定法: 急速冷冻的直接测定法( 荧光分光光度计 - 化学发光法 , 分 光光度计 - 细胞色素 C法) 、 自旋捕捉法 ( 超过氧化物清除剂 和捕捉剂竞争自由基反应, 从自旋加和物的量可计算出自由基 清除剂的活性 ) 7. 羟基自由基测定法 : Fenton反应 ( 四) 基础生化检测 蛋白质测定: 280nm光吸收 ( 直接测定 ; 含有嘌呤嘧啶等核酸1.45A280-0.74A260; 肽键 200-250 有吸收 0.144( A215-0.74A225) ) 双缩脲法 ( 紫红色化合物 , 1-10mg/ml 540nm 测定) Lowy 法( 双缩脲紫色再加
15、磷鉬酸 - 磷钨酸试剂 , 深蓝色, 0.03-0.3mg/ml 750nm 测定、 0.05-0.5mg/ml 510nm测定) BCA 法 ( 蛋 白 质 将Cu2+还 原 成Cu+, 后 者 与BCA 生 成 紫 色 复 合 物 , 资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 10-1200mg/ml562nm) 粘多糖的定量及生物活性测定: 理化测定 ( 菲林试剂、蒽酮法、氨基己糖测定 ) 生物测定 ( 抗凝血活性测定 : 与标准品肝素对照得出效价; 降脂活性测定评价 : 酶使胆固醇产生过氧化氢, 与显色剂反 应呈红色 , 粘多糖类降脂作用使吸光度下降) 核酸含量测
16、定 : : 地衣酚法 ( 浓硫酸 +RNA+ 地衣酚生成蓝绿色复合物 , 670nm 测定) 生物大分子纯度测定 : HPLC、 电泳法、生物效价测定、分光光度法 常见研究方法 : 1. 过氧化脂质测定法 ( LPO) 评价过氧化脂质产生和积累的重要生化指标 比色法 : 硫代巴比妥酸 TBA显色法: TBA与 MDA 形成红色化合物 , 532nm 检测( 灵敏度较差 , 特异性差 , 回收率低 , 偏低) ; 氧化还原比色法 荧光法 : TBA 荧光沉淀法 ( 原理同 TBA比色法 , 515nm 激发, 553nm 测定) 、 简易荧光法、 谷胱甘肽荧光法 ( 氧化型谷胱甘肽 , 343nm激发, 420nm测定, 特异性高 ) 、 亚甲 蓝比色法 ( Fe 离子影响大 ) 紫外法 : 测血清 化学发光法 : 灵敏, 简便。 a 冷光剂鲁米诺等在自由基作用下获能, 回到基态时释放光量 子( LCL) b血清自发化学发光 ( SCL) 电子自旋共振法 :
