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1、基金申请的策略和技巧,黎 明 涛 中山大学蛋白质组学研究中心 中山大学基础医学院药理教研室,基金申请,选题 撰写申请书 答辩,撰写前的准备,好心情、好身体 边想边写 3h /天 读指南、读通知 注意截止期 读标书、读高手、读同行 读自己 卖点！？选题 创新性 工作基础 想法变文字 一气呵成 “立项依据” 沟通 科研科87330567、医科处 87333055,立 项 依 据,1. 关键! 占50% 文笔流畅、层次分明、逻辑性强 2. 要求：充分的理由和意义 思想性 与摘要呼应 3. 自己的工作为依据 图文并茂 规范 4. 参考文献 时效性 自己的文章 规范化 5. 深入浅出 内行、外行读得懂
2、6. 人文文化 素质 精神 动人的故事,神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控,细胞凋亡 时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控 神经元凋亡时 BH3-only蛋白Bim的转录调控 神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的 调控 SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控 SP1对神经元凋亡的调控作用 关键词：SP1/Bim /基因调控/信号转导/神经元凋亡,项 目 名 称,研究内容、研究目标与拟解决的关键问题,研究目标 获得SP1直接调控bim基因表达的可靠证据，阐明促凋亡蛋白Bim由SP1转录调控的新机制，为确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更
3、充分的科学依据。 要求：明确、具体 解决学术问题,神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控,与题目相呼应,研究内容 （紧紧围绕研究目标） 1.证明bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调 为了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调，将其中的SP1结合序列进行点突变，使其不能结合SP1；确定这一突变是否能够消除bim启动子的撤钾反应。 2.分析SP1 是否能够与bim启动子核心区的SP1结合序列结合 应用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技术，证实bim启动子核心区的SP1 结合序列
4、是否能够与SP1结合；进一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法，获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结合的证据。 3.从 bim 的mRNA 和蛋白质水平，观察负显性SP1是否能够抑制撤钾诱导的bim基因的上调 质粒转染CGNs的转染率只能达到0.1-1.0 %，腺病毒的感染率可达7080%1。 因此，构建dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1，感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。 4. 分析SP1诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用 确立SP1转录激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作
5、用。,拟解决的关键问题 获得SP1直接调控bim基因表达的可靠依据。 什么是关键问题？ 研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。 为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。,撰写要求：找出关键问题，问题清晰，分析透彻， 合理的解决方法。,研 究 方 案 项目需求为前提； 可靠性第一，先进性第二； 参考文献； 突出关键技术的描述； 不主张使用流程图，建议开头：“有关方法、技术路线、试 验手段、关键技术综述如下”。,可行性分析 从学术思想角度提出,1. 工作基础 （学术思想） 2. 科研梯队 3. 实验条件 4. 实验技术 5. 交流与合作（国内、国外）,创 新 性 对创新的理
6、解：创新性与先进性是有根本区别的。 原始创新： 填补空白或修改传统的理论； 新技术、新方法的发明创造。 跟踪创新： 在前人工作基础上补充、完善现有理论； 对原有技术、方法进行修改后产生112的效果。,本项目的特色与创新之处： 申请人首次报道了神经元凋亡时促凋亡蛋白Bim上调是不依赖于JNK/c-Jun通路(Leyu Shi,et al, Neurosci Lett. 2005)一观察之后，又以可靠的实验结果证明PI3K/Akt/FKHRL1信号通路也不参与bim的上调（见立项依据）。 bim上调的转录机制是什么？我们率先对bim启动子进行了5末端序列续减分析，确立了诱导bim表达的启动子核心区
7、， 进而发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1突变体和SP1-DNA结合抑制剂mithramycin A可抑制bim的上调。根据以上生物信息学分析和实验观察，我们首次提出了SP1介导bim上调这一新的bim转录机制：神经元凋亡时转录因子SP1被激活，激活的SP1与bim启动子核心区的SP1结合序列结合，从而转录激活bim的表达。 本项目拟进一步采用负显性SP1突变体的腺病毒表达技术以及启动子点突变、EMSA和CHIP方法，旨在获得SP1直接调控bim基因的可靠证据，为阐明SP1对促凋亡蛋白Bim的调控作用和机制并进一步确立SP1作为
8、神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。,研究基础与工作条件 突出与项目相关的工作积累,研究基础 已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累(对于自由申请项目，着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩) 工作条件 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径(包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况),研究 基 础,在国家自然科学基金(已结题三项、正进行一项)的资助下，近五年有如下工作积累和成绩： 1.SCI论文 近五年发表了14篇SCI论文；其中与神经元凋亡的信号转导和基因调控有关的论文
9、，作为第一作者的有2篇，作为通讯作者的有4篇(见后)，作为共同作者的有8篇。 2. Bim转录机制的前期工作 我们首次报道了神经元凋亡时JNK/c-Jun不参与bim的上调1，随后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介导bim的上调(未发表资料)。这些研究工作改变了以往的观点,也是本项目重要的立项依据之一。,3. Bim启动子核心区确立 启动子5末端序列续减分析确立了诱导Bim表达的启动子核 心区，并发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1突变体和SP1-DNA结合抑制剂均可抑制Bim的上调。这些实验资料揭示
10、了SP1介导 bim转录调控的新机制，也为本项目申请提供了最根本的实验依据。 4. 转录因子调控神经元凋亡的工作基础 另一项转录因子MEF2抗神经元凋亡的工作也显示了申请人与本项目相关的较扎实的研究工作积累。本人首次报道(Mingtao Li, et al, J of Neurosci. 2001, 21:6544-6552 )、随后被他人证实(Shu-ichi Okamoto, et al, PNAS 2002, 99:3974-3979)，神经元凋亡时转录因子MEF2A和MEF2D不仅活性降低和失去抗凋亡作用，而且被凋亡杀手caspase 剪切，其N-末端产物反而具有促凋亡活性。这一MEF
11、2调控凋亡机制的发现，不仅对于我们理解神经元存活或凋亡具有重要的意义，而且也为神经系统的发育和分化的研究开拓了一条崭新的思路，具有创新性。,5. 信号转导的工作基础 较早的一项对cAMP / PKA 抗神经元凋亡机制的研究也反映了本人在神经元凋亡信号转导的研究方面有较厚实的工作积累。申请者首次发现促凋亡激酶 GSK-3 和GSK- 3是PKA的天然底物；阐明cAMP/PKA 通过磷酸化并抑制GSK-3发挥其促神经元存活的作用，此内容发表在分子细胞生物学( Mingtao Li, et al, Mol Cell Biol. 2000, 20: 9356-9363)。 6. JNK/c-Jun通路
12、的工作基础 我们首次以JNK/c-Jun为直接靶点、用小分子JNK抑制剂(SP600125)治疗帕金森病动物，证实JNK是有效的治疗靶点。此工作发表后 (Neuroscience Research, 2004; 48:195-202)，得到了国际同行的认可。SCI期刊Drug News Perspectives邀请本人撰写了有关“以JNK为靶点治疗帕金森病”的专题综述“JNK Inhibition as a Potential Strategy in Treating Parkinsons Disease”(Drug News Perspect. 2004; 17:646-54)。,SCI 文
13、 章,1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and Mingtao Li(通讯作者). Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activati
14、on during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：712. 2. Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通讯作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parkinsonss disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54. 3. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenm
15、ing Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. (通讯作者). SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinsons disease. Neurosci Res 2004；48:195-202 4. Yuanbin Xie, Yanling Liu, Chi Ma, Zhongmin Yuan, Wenya Wang, Z
16、henyu Zhu, , Guoquan Gao, Xianguo Liu, Hengxin Yuan, Ruzhu Chen, Shoujian Huang, Xuelan Wang, Xiaonan Zhu, Xuemin Wang, Zixu Mao and Mingtao Li (通讯作者). Indirubin-3-oxime inhibits c-Jun NH2-terminal kinase: anti-apoptotic effect in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2004, 367:355-359.,5. Rongbiao Pi, Wenming Li Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J.Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan
