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1、2020/8/22,1,凝胶过滤层析法,凝胶过滤层析（分子筛层析、排阻层析）,2020/8/22,2,一、凝胶过滤介质,凝胶过滤(gel filtration)是利用凝胶的网状结构根据被分离物质分子大小进行分离的一种方法。,凝胶过滤的优点：,1、介质为不带电的惰性物质，不与溶质分子作用，分离条件温和，收率高，重现性好,2、工作范围广，分离分子量的覆盖面大,3、设备简单，易于操作，周期短，可连续使用。,2020/8/22,3,凝胶过滤介质应具备的条件,1、介质本身为惰性物质，在应用过程中它不与溶质、溶剂分子发生任何作用,2、应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少非特异吸附性，提高蛋白质的收率,
2、3、介质内孔径大小要分布均匀,4、凝胶珠粒大小均匀,5、介质要具有优良的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒，延长了介质的使用寿命,2020/8/22,4,常见的凝胶种类,1、多糖类骨架的介质：以天然多糖为母体的凝胶过滤介质，这类介质具有亲水性及与生物大分子的相容性，可允许生物大分子透过而不发生变性。这类介质的缺点是多为软基质，压力降大时不易操作。因此在经典的多糖类介质的基础上又生产出刚性、半刚性的骨架和琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶(超胶Superdex)高效介质。,2020/8/22,5,凝胶过滤介质的种类,2、合成大分子骨架的介质：选用高亲水性单体，经共聚反应而合成的多孔结构过滤介
3、质。主要产品有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系及羟甲基酰胺类。,3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质,2020/8/22,6,主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构,2020/8/22,7,主要的凝胶过滤 介质,(一)、葡聚糖系,1、葡聚糖系Sephadex,结构：以氯代环氧丙烷为交联剂的葡聚糖珠状凝胶，依据孔径不同形成G型凝胶系列产品，G后数字表示凝胶的吸水量，是其吸水量的10倍。G也表示凝胶交联度的大小，G越小，交联度越大，孔径越小，排阻的分子越小。,2020/8/22,8,2020/8/22,9,2、性能：,(1)溶胀性 Sephadex系均以干态供应，使用前必须在过量的溶剂中充分溶胀后才能使
4、用。,(2)化学稳定性 Sephadex不溶于一切溶剂，在水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸溶剂中均较稳定。因葡聚糖中的糖苷键在强酸中可发生降解作用，所以只能接触强酸的稀溶液，在0.1mol/L盐酸中可接触12小时，在0.02mol/L盐酸中经6个月均无明显变化，但要避免作用氧化剂。,2020/8/22,10,(3)物理稳定性 pH中性湿态珠体可经受120、30min高压灭菌而不影响色谱性能,(4)机械强度 Sephadex凝胶的机械强度取决于交联度，交联度越大，机械强度越高。机械强度与柱床所能承受的压力有关，其压力与流速的关系为：,V：线速度， cm/h； P：压力降，cm水柱；L：床高；K：比
5、渗透率，受粒径影响较大。,2020/8/22,11,葡聚糖凝胶(G),2020/8/22,12,Sephadex的型号及性能,2020/8/22,13,3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。,4、衍生系：在经典葡聚糖凝胶的基础上，引入特殊基团后生成葡聚糖凝胶的衍生系，主要有LH系，如以G25为母体引入羟丙基成LH20，以G50为母体引入羟丙基成为LH60。特点是LH系除具有凝胶过滤的作用外，同时具有分配层析及吸附层析的作用。,2020/8/22,14,Sephadex
6、经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。,LH系列主要用途：用于有机溶剂中的凝胶过滤，尤其适用于嗜脂性分子及制备各种天然产物； 结合凝胶过滤、分配层析及吸附层析的特点，能分离结构非常相近的分子及其他凝胶难以处理的样品； 排阻极性与原母体凝胶相同。LH20对芳香多环化合物的分离比LH60好而LH60更适用于分配层析。 对样品的负载量大，负载量可高达300mg/ml凝胶。,2020/8/22,15,(二)、琼脂糖系 由经过纯化的琼脂糖制备，其中含有极小的带电基团。利用琼脂糖热溶液冷却时可凝胶化的特点，能方便地制成珠状物。在凝胶过程中由单独的多
7、糖链先形成双螺旋，然后聚集成胶束。胶束之间有孔，孔的大小取决于胶束的多少即琼脂糖的浓度。传统的琼脂糖凝胶非特异性吸附极低，分离范围很广，分离范围从1000040000000，所以适用于分子量差距较大的分子间分离，分辨率不很高。琼脂糖凝胶有两种牌号BioGel A系和Sepharose,2020/8/22,16,2020/8/22,17,BioGel A系型号及性能,2020/8/22,18,Sepharose系型号能性能,2020/8/22,19,Sepharose是该系中最早的产品，为非交联结构，因此不能进行高压灭菌，仅能在240范围内使用。根据琼脂糖含量的不同，对含量为2、4及6的产品分别
8、命名为2B、4B和6B。由于新型凝胶的不断出现，此型凝胶有逐渐被淘汰的趋势。,2020/8/22,20,Sepharose CL是琼脂糖珠体与2，3二溴丙醇反应后具有共价交联键的产物。交联结构大大提高了珠体的热稳定性及 物理化学稳定性，但对孔结构无明显影响。交联后凝胶在还原条件下经碱水解去除了硫酸根，减少了带电基团，使非特异吸附比其母体小。凝胶在中性条件下可经受120 消毒，处理后其色谱性能不变。特别适用于含有机溶剂的分离，流速比传统的Sepharose有明显提高并可广泛用于离子交换剂及亲和吸附剂的母体。,2020/8/22,21,Superose由珠状琼脂糖经过两次交联而制备的新型凝胶。用含
9、双环氧基及多环氧基的混合长交联剂对琼脂糖珠体进行第一阶段交联，然后再与含双环氧基的短链交联剂进行第二次交联。经两次交联反应后的珠体大大提高了介质的刚性和增强了物理化学稳定性。用0.1mol/L的HCl溶液及0.1mol/L的 NaOH在40处理两周，色谱性能无明显变化，还可经受70甲酸及30乙腈处理。,2020/8/22,22,Superose为刚性半刚性珠体，在高黏性液体如8mol/L尿素下也能保持适当流速将广泛的分离范围及高分辨率集于一身，适用于糖类、核酸、病毒等的分离，特别是包含体蛋白在促溶剂中的纯化。能一次性分离生物分子大小差异较大按的混合物。由于颗粒细小，粒度分布均匀，柱效高，可允许
10、高流速，适用于中、高压层析系统分离。,2020/8/22,23,Sepharose Fast Flow 是新型的BioProcess凝胶介质，经过高度交联的琼脂糖珠体。具有机械强度高、流速快、极高的物理化学稳定性及非特异性吸附极低等特点，而适合工业规模生产使用。对蛋白质的回收率很高，并可用多种促溶剂及有机溶剂或12mol/L的NaOH进行清洗。,2020/8/22,24,(三)、聚丙烯酰胺系,由丙烯酰胺与N,N亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的亲水性凝胶。是结构稳定的合成高聚物，不受微生物侵蚀，可在120消毒30min后，色谱性能不变。干胶的羧基含量3.0mmol/g，含有极少的游离电荷，所以非特异性
11、吸附很小。还可以通过改变交联剂的用量控制凝胶孔径的大小，得到不同排阻极限的系列产品。,2020/8/22,25,2020/8/22,26,BioGel P类凝胶,2020/8/22,27,(四)、Sephacryl系列,由烯丙基葡聚糖与N,N亚甲基双丙烯酰胺经共聚而成的一种共价交联的刚性珠体，有6种不同的分离范围，具有广阔的选择性，具有良好的机械性能，可进行快速的高分辨率的纯化。其稳定性能可用0.5mol/L的NaOH进行清洗及再生。由于其化学稳定性，使其既适用于水溶液，又可用于多种有机溶剂体系。可在科研及工业生产中应用。,2020/8/22,28,2020/8/22,29,Sephacryl
12、系列产品性能,2020/8/22,30,(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40处理400小时而分辨率保持不变。,2020/8/22,31,Superdex结构,2020/8/22,32,Superdex(BioPrecess介质)素列产品性能,2020/8/22,33,(六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交
13、联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质，20世纪80年代初部世，由美国R流速：180ml/cm2h-1 未加葡聚糖2000，粘度：1.0厘泊,2020/8/22,68,血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱： 4cm85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2h-1 加2.5%葡聚糖2000，粘度：4.2厘泊,2020/8/22,69,血红蛋白在凝胶过滤柱上的分离图谱，层析柱： 4cm85cm,Sephadex G-25;流速：180ml/cm2h-1 加5.0%葡聚糖2000，粘度：11.8厘泊,2020/8/22,70,在特殊情况下，为使层析形成很好的界而，希望样品的比重大一些
14、，可用向样品中加入蔗糖的办法实现。如加蔗糖的量不太大时，可取得很好的效果，但一般要将粘度控制在5厘泊以内。如粘度太大时效果可能适得其反。,2020/8/22,71,洗脱：凝胶过滤的洗脱比较简单，除极个别特殊情况外都用单一的缓冲液。与一般交换树脂洗脱不同，洗脱液加在柱上的压力与流速之间没有直线关系。尤其是交联度小的凝胶，当压力差大时流速反而降低。压力与流速的关系如图：,2020/8/22,72,2020/8/22,73,柱体积：2cm65cm：凝胶Sephadex G25(5080目)； 样品：尿甘酸,100ml/h,2020/8/22,74,凝胶过滤的应用,1、脱盐和浓缩,2020/8/22,
15、75,2、生命物质的分离,2020/8/22,76,2020/8/22,77,2020/8/22,78,3、分子量的测定：测定大分子的分子量是凝胶过滤的应用之一。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之间又存在线性关系，利用这一关系可绘制出Kav与分子质量的标准曲线。,2020/8/22,79,2020/8/22,80,2020/8/22,81,方法的局限性：,1、在pH68的范围内，直线关系比较好，在极端pH时因蛋白质变性而引起偏离；,2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋白质的轴比较大时，会引起测定偏离；,3、糖蛋白的含糖量大于5时，测得的分子量比真实分子量大。,2020/8/22,82,
