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1、第三章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC),31 高效液相色谱法的特点 一、概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。,70年代迅速发展 80年代以来HPLC 文献量 21%（89年） 仪器销售量 25%（12 亿）（89年） 应用领域 拓展（化工、环保、临床、药品、生命） 超过 GC,慢 中等
2、快,色谱分离,液相色谱仪,HPLC的特点：,“三高” “一快” “一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快(高速) 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力
3、，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,32 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素,气相色谱所讨论的基本概念及基本理论,如:保留 值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理 论等与液相色谱一致，但液相色谱流动相为液体，其 扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的差别，都 将对色谱分析过程产生影响。,该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。,（一）H
4、PLC中的速率理论,涡流扩散A=2dp 球形、小粒度、均匀（RSD5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。 纵向扩散B=2Dm 可以忽略。 因为D很小，室温操作，且u大于u最佳,2、液相色谱传质阻力：,（2）流动相传质阻力项,（3）流动相滞留传质阻力项,（1）固定相传质阻力项 (固定液厚度df极小),C都是常数,(二) HPLC法中提高分离效率的措施,1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相甲醇，1mL/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右,33 高效液相色谱法的类
5、型 及其分离原理,液液分配色谱 （LLPC） 化学键合相色谱(CBPC) 液固吸附色谱(LSAC) 离子交换色谱(IEC) 离子对色谱(IPC) 离子色谱(IC) 尺寸排阻色谱(SEC) (凝胶色谱法 Gel C) 亲和色谱(AC),高 效 液 相 色 谱 法 类 型,（）液液分配色谱法（LLPC） 及化学键合相色谱(CBPC) 1分离原理 分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。与气液色谱一样，固定液是涂渍在担体表面；与气液色谱的不同之处在于，液相色谱的流动相种类对分配系数有较大的影响。,2、正相分配色谱和反相分配色谱 根据所用流动相和
6、固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性。它适用于极性化合物的分离。 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。,液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。,3、化学键合相色谱 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法，代替了固定液的机械涂布，它的分离机理：一
7、般认为分配和吸附两种作用兼有。 可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破，对液相色谱的迅速发展起着重大作用 。它是目前应用最广泛的一种固定相。,键合固定相,非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（十八烷基键合硅胶）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。,二、吸附色谱（adsorption chromatography） 原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。 固定相： 固定相通
8、常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。,流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。,应用： 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。,三、离子交换色谱 （ion exchange chromatography, IEC） IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺
9、盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。,SO3H + M+,SO3M + H+,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等
10、。,（四）离子色谱法（IC）,离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，因有些被测离子不能采用紫外检测器，若采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。,因此，就在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。,当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制
11、柱中发生两个重要反应： R+OHH+Cl- R+Cl+H2O R+OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理，也是水溶液中阴离子分析的最佳方法。,（五）离子对色谱法（IPC）,1分离原理 离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。 离子对形成机理：假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相
12、，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子A-相反的离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的组分离子生成疏水性离子对化合物A-B+。,由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。 离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。,阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；,（六）尺寸排阻色谱法（SEC） （又称凝胶色谱和分子筛色
13、谱） 原理： 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。,大分子全排出 小分子全进入,尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后流出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。,(七)亲和色谱法（AC）简介,亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体表面先键合一种具有一般
14、反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。,3-4 液相色谱固定相 stationary phases of LC,1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；,化学键合固定
15、相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （4）有利于梯度洗脱；,ODS（十八烷基键合硅胶）柱,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：510 m；,3.离子交换色谱分离
16、固定相,结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,4. 空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,3-5 液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1. 流动相特性
