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1、2017/6/15,1,第十章 甾体激素类药物的分析,2017/6/15,2,甾体激素类药物是一类具有甾体结构的激素类药物，有非常重要的生理功能。,分类(按药理作用):,结构特点：具有环戊烷并多氢菲母核。,类风湿性关节炎、频发性哮喘等,肾上腺皮质功能不全,休克,重症肌无力,甾,A环、B环有一个或两个双键,2017/6/15,3,主要可供分析基团：1. 3-酮，C20酮基,3.C17:,2. C11：,肾上腺皮质激素(天然产物或天然产物的结构改造产物)：,氢化可的松,醋酸地塞米松,曲安西龙,地塞米松磷酸钠,地塞米松磷酸钠：增强水溶性,氢化可的松：天然皮质激素,醋酸地塞米松：肌注延长作
2、用时间,2017/6/15,4,雄性激素及蛋白同化激素(天然产物或天然产物的结构改造产物)：雄性激素同时具有蛋白同化激素作用，经结构改造后，雄性激素作用减弱，同化作用保留或增强，成为蛋白同化激素。,甲睾酮,丙酸睾酮,苯丙酸诺龙,结构特点：1. 3-酮基；2. C17： 有羟基或酯基,丙酸睾酮：C17酯化后延长作用时间,蛋白同化激素,雄性激素,雄性激素：母核有19个碳原子蛋白同化激素：母核有18个碳原子,C10一般无角甲基,C17- 羟基或它形成的酯,2017/6/15,5,孕激素 (天然产物或天然产物的结构改造产物)：天然孕激素为黄体酮，口服无效，经结构改造后得到口服有效及长效衍生物。,醋酸甲
3、地孕酮,黄体酮,结构特点：1. 3-酮基；2. C17： 有甲酮基 有些药物有羟基或酯基,2017/6/15,6,雌性激素 (天然产物或天然产物的结构改造产物)：天然雌性激素为雌二醇，经结构改造得到高效及长效衍生物。,炔雌醇,雌二醇,结构特点：1. A环为苯环2. 3-酚羟基；3. C17： 羟基 有些药物有羟基成酯，或有炔基,2017/6/15,7,几种甾体激素类药物结构的比较：皮质激素：有21个碳原子，C17-酮醇基，或该醇基形
4、成的磷酸酯或磷酸酯的二钠盐 雄性激素：母核有19个碳原子蛋白同化激素：母核有18个碳原子孕激素：母核有21个碳原子C17-甲酮基雌性激素 ：母核有18个碳原子A环为苯环，C17上常有炔基,2017/6/15,8,鉴别试验,制备衍生物测熔点,光谱法,色谱法,呈色反应：与强酸反应(维生素D：醋酐+硫酸) 官能团反应,化学鉴别法,UVIR,TLC HPLC,2017/6/15,9,甾体激素与硫酸、盐酸、磷酸、高氯酸等强酸反应呈色。,甾体激素与硫酸的呈色反应操作简便，不同药物可形成不同的颜色或荧光而能相互区别，反应灵敏，为各国药典所应用,2017/
5、6/15,10,-醇酮基有还原性，可与碱性酒石酸酮试液(红色Cu2O)，氨制硝酸银试液(黑色Ag)，四氮唑试液反应。,还可用于皮质激素类药物杂质检查(TLC)时的显色剂，皮质激素类药物的含量测定,不同的甾体激素药物有不同的官能团，利用官能团反应可区别不同药物。,1、C17-醇酮基的呈色反应肾上腺皮质激素类,2017/6/15,11,2、酮基的呈色反应 C3和C20位的酮羰基可与羰基试剂(2,4-二硝基苯肼，硫酸苯肼，异烟肼等)反应，生成黄色的腙而用于鉴别。 如黄体酮的鉴别：取供试品约0.5mg，置小试管中，加异烟肼
6、约1mg和甲醇1ml溶解后，显黄色。,3、甲酮基的呈色反应 黄体酮与亚硝基铁氰化钠反应，显蓝紫色，可认为是黄体酮的灵敏、专属的鉴别反应。其它分子结构中含有甲酮基的甾体激素呈现淡橙色或不显色。,4、酚羟基的呈色反应 雌激素的C3位上有酚羟基，可与重氮苯磺酸反应生成红色偶氮染料(JP：苯甲酸雌二醇)。,5、炔基的沉淀反应 具有炔基的甾体激素药物(炔雌醇、炔诺酮等)，遇硝酸银试液，即生成白色的炔化银沉淀。 R
7、-CCH + AgNO3 R-CCAg + HNO3,还可用于含量测定,2017/6/15,12,6、卤素的反应 对连接在C6,C9或其它位置上的氟或氯进行确认。 (1)卤素连接在母核的环上：需用氧瓶燃烧法破坏，使有机卤素转变为无机卤素离子，再进行鉴别(如地塞米松磷酸钠，丙酸倍氯米松)。 (2)卤素连接在侧链上：可通过加热水解方法产生卤素离子，再进行鉴别(如丙酸氯倍他索)。,7、酯的反应 有些本类药物，在C17或C21位上连接有酯基，可将其水解，产生相应的羧酸，再根据羧酸的
8、性质进行鉴别(如醋酸泼尼松，己酸羟孕酮等)。,醋酸,在酸性条件下与乙醇生成醋酸乙酯，有香气,己酸，有特臭,2017/6/15,13,部分本类药物用测定衍生物熔点的方法进行鉴别1、缩氨基脲的生成 C3位的羰基和氨基脲发生缩合，生成缩氨基脲，可测定其熔点，对药物进行鉴别。 如苯丙酸诺龙，产物熔点约为182，熔融同时分解。2、酯的水解 若结构是有机酸的酯，可水解后测定产物熔点。 如丙酸睾酮C17位是丙酸和睾酮形成的酯，碱性水解后得到睾酮，熔点
9、应为150156。3、酯的生成 某些药物有羟基，可与酰卤生成酯，可测定酯的熔点进行鉴别。 如炔雌醇C3位上的羟基与苯甲酰氯成酯后，熔点为200202。4、酮肟的生成 有些药物C3位的羰基可与羟胺形成肟，可测定肟的熔点对药物进行鉴别。 如黄体酮与盐酸羟胺反应后生成黄体酮双肟，熔点为235240。,2017/6/15,14,UV：甾体激素类药物有共轭结构或有苯环，有紫外特征吸收，可规定其最大吸收波长max，max处的吸收度，或某两个波长处吸
10、收度的比值进行鉴别(如中国药典中丙酸倍氯米松的鉴别 )。IR：对于本类药物，几乎所有药物原料药都采用IR进行鉴别。,2017/6/15,15,TLC：多数甾体激素类药物的制剂，部分原料药常采用TLC法进行鉴别。如丙酸睾酮注射液：供试品和对照品配制浓度一致。展开后，供试液主斑点的颜色和位置应与对照液主斑点相同。HPLC：部分甾体激素类药物用HPLC法测定含量，可同时进行鉴别。要求在一定色谱条件下，供试品的保留时间与对照品的保留时间一致。,2017/6/15,16,特殊杂质检查甾体激素类药物通常要做“其他甾体”检查；根据药物在生产和贮存过程中可能引入的杂质，有的药物还需做“游离磷酸盐”、“硒”及有
11、机溶剂残留量检查等。,2017/6/15,17,甾体激素药物多由其它甾体化合物结构改造而来，可能引入的杂质有合成的原料，中间体，副产物，降解产物，异构体等，其结构一般未知，但具有甾体结构，与药物结构类似。方法：TLC或HPLC法进行检查。,其它甾体检查,2017/6/15,18,TLC法：多数杂质结构未知且与药物结构相似，用高低浓度对比法来检查。例：醋酸氟轻松中“有关物质”检查： 取本品，加三氯甲烷-甲醇（9：1）溶解并制成每1ml中约含3mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（9：1）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录 &
12、nbsp;B）试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（97：3）为展开剂，展开，晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。氢化可的松和雌二醇见课本p252展开剂：不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶剂；苯-无水乙醇；二氯甲烷-甲醇-水；三氯甲烷-甲醇等。显色剂：碱性四氮唑蓝试液；硫酸-乙醇(2:8；1:1；3:7)；20%硫酸；10%磷钼酸-乙醇液,2017/6/15,19,HPLC法不少甾体激素药物用HPLC法测定含量，一般可在相同条件下检查其他甾体。
13、方法为主成分自身对照法。以供试品溶液的稀溶液为对照液，将对照液主峰的面积作为参比，来控制药物中杂质的量。,例：黄体酮中“有关物质”检查：取本品适量，精密称定，以甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取1ml，置50ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10l，注入液相色谱仪，调整检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的50%。再精密量取供试品溶液 与对照溶液 各10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，不得多于1个。其峰面积不得大于对照溶液 主峰面积的3/
14、4 。,14.3,时间(min),14.3,22.2,2017/6/15,20,游离磷酸盐 对于地塞米松磷酸钠，倍他米松磷酸钠来说，二者都是在C21位上羟基与磷酸形成的磷酸酯二钠盐，在药物的生产和贮存过程中可能引入磷酸盐，因此，要对药物中的游离磷酸盐进行检查。,例：地塞米松磷酸钠中游离磷酸盐检查 精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml使溶解；另取标准磷酸盐溶液精密称取经105 干燥2 小时的磷酸二氢钾0.35 g ，置100ml量瓶中，加硫酸溶液(310)10ml 与水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀；临用时再稀释10倍4.0ml
15、，置另一25ml量瓶中，加水11ml；各精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml 与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液(取无水亚硫酸钠5g、亚硫酸氢钠94.3g 与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.7g，充分混合，临用时取此混合物1.5g加水10ml使溶解，必要时滤过)1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟。照紫外-可见分光光度法（附录A），在740nm 的波长处测定吸光度。供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。 原理：磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，再被1-氨基-2萘酚-4-磺酸溶液还原，所得磷钼酸蓝在740nm有最大吸收。比较供试液与对照液的吸收度控制药物中游离磷酸盐的量。,
16、2017/6/15,21,硒的检查 醋酸氟轻松，醋酸地塞米松，醋酸曲安奈德等甾体激素在生产过程中用到二氧化硒脱氢。二氧化硒对人体有剧毒，故需检查。 原理：先将药物用氧瓶燃烧法有机破坏后，使硒转化为高价氧化物(SeO3)，以硝酸溶液吸收；再用盐酸羟胺将Se6+还原为Se4+；在pH2.0条件下，与二氨基萘试液作用，生成 4，5-苯并苯硒，被环己烷提取后，在378nm有最大吸收。 规定：供试液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度。醋酸氟轻松(0.01%)醋酸地塞米松(0.005%)醋酸曲安奈德(0.005%)。,2017/
17、6/15,22,有机溶剂残留量测定 在甾体激素类药物合成过程中，用到的有机溶剂种类多，数量也多，故在部分品种中要测定有机溶剂残留量。,例：ChP中地塞米松磷酸钠中甲醇和丙酮的检查(GC法) 取本品约0.16g，精密称定，置10ml 量瓶中，精密加0.1(ml/ml)正丙醇(内标物质)溶液2ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取甲醇约7.9mg与丙酮约79mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，精密加内标溶液2ml，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取供试品溶液与对照品溶液，照残留溶剂测定法（附录 P），用高分子多孔小球色谱柱(按正丙酮计算的理论板数大于700)，在柱温150 测定。含量丙酮不得超过5.0%(g/g)，并不得出现甲醇峰。,2017/6/15,23,1、HPLC法 2、UV法3、比色法,异烟肼比色法四氮唑比色法Kober反应比色法,含量测定,2017/6/15,24,HPLC法 广泛用于甾体激素类药物原料和制剂的含量测定(占药典收载原料和制剂总量的一半以上)。多采用反相HPLC法，用内标法计算。,
