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1、,第三章 蛋白质Proteins,生物化学,第六节 蛋白质的测序 (peptides),一、肽的定义与肽键二、肽的书写三、自然界中存在的小肽四、肽的理化性质,蛋白质肽链结构学说的证据：肽键是一个酰胺键。（1）蛋白质水解前后的结果分析。（2）人工合成的多肽和天然蛋白质，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中氨基酸是肽键连接的。（3）天然蛋白质有双缩脲反应。（4）人工合成的聚合aa的X-光衍射谱和红外光谱与天然纤维蛋白相似。（5）结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽链结构学说的正确性。,一、蛋白质中氨基酸之间的连接键是主要的是肽键,两个氨基酸分子头尾连接起来,肽键的形成,脱水,Car
2、bodiimide,Juang RH (2004) BCbasics,肽的结构与肽键,氨基酸借肽键连接的分子叫肽，肽是一大类物质，即：,1）两个氨基酸组成的肽叫二肽；2）三个氨基酸组成的肽叫三肽；3）多个氨基酸组成的肽叫多肽；4）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有 自由-NH2和-COOH，自由-NH2端称为N-末端（氨基末端）， 自由-COOH端称为C-末端（羧基末端）；5）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；6）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N指 向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。,二、肽的定义与结构,单位小分
3、子 N-C-C-N-C-C-N-C-C,-碳为中心 N-C-C-N-C-C-N-C-C,两端氨基酸 N-C-C-N-C-C-N-C-C,肽键的定位 N-C-C-N-C-C-N-C-C,肽的结构分析,Juang RH (2004) BCbasics,肽的书写,写法：从左右，从N末端C末端。 三字母用连线，也有用单字母的。读法：酰酰 酸。,写法： Ser-Gly-Try-Ala-Leu 或SGTAL，名称：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸,p 轨道电子共振使肽键具双键特性,-
4、,+,N,C,C,N,C, 肽键 虽是单键却有双键性质，不能自由旋转, 肽键 周围六个原子在同一平面（酰氨平面）上, 相邻两个氨基酸的 -carbon 在对角 (trans)，反式,C,肽键的特点,sp2,sp2, 肽键亚氨基在pH 0-14内不解离。,Pro形成的肽链肽平面是可以反式也可以顺式。,两肽键 平面的交接点为 a-碳,以肽键平面连接成多肽长链,注意 a-碳上面接有各种大小不等的基团,Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.136,多肽链可以看成由Ca串联起来的数个酰胺平面组成,氨基酸残基,氨基酸残基,1、
5、 旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。2、 肽的酸碱性质短肽在晶体和水溶液中是以偶极离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于N端a-NH和C端a-COOH以及侧链R上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。,三、肽的物理化学性质,pH 优势离子的净电荷：<3.5 0="" 1="" 2="" 3.5-4.6="" 4.6-7.8="" 7.8-10.2="" -1=""
6、;>10.2 -2,等电点：,3、肽的等电点：,肽的a-羧基，a-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。双缩脲反应NH2-CO-NH-CO-NH2 (双缩脲），能与CuSO4-NaOH产生颜色反应。凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。,4、肽的化学反应,1、 谷胱甘肽（GSH） 三肽（Glu-Cys-Gly），广泛存在于
7、生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。,四、天然存在的活性肽,g-肽键,a,b,g,2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨酸），可促进甲状腺素的释放。,3.短杆菌素S：环十肽，含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。,4.青霉素：含有D半胱氨酸和D缬氨酸的二肽衍生物 。主要破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引起溶菌。,5.牛催产素与加压素：均为九肽,7.脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用。,6.舒缓激肽：促进血管舒张，促进水、钠离子的排出。,脑啡与其受体结合后可以产生镇痛效果,
8、麻啡可以模拟脑啡的作用，因此有类似的效用,L-Aspartyl-L-phenylalanine methyl ester,Aspartame,阿斯巴甜,甜度是蔗糖的180倍,第四节 蛋白质的结构The structure of proteins,一、蛋白质的一级结构二、蛋白质的二级结构三、蛋白质的三级结构四、蛋白质的四级结构,一级结构,蛋白质的四级结构,氨基酸,四级结构,三级结构,二级结构,一级结构（共价结构）：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。,一、蛋白质一级结构（初级结构）Primary structure,（一）、一级结构的研究内容与研究意义研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质的结构与功能的
9、基础，主要研究内容：1、氨基酸是如何连接成蛋白质，2、对于一定的蛋白质,氨基酸的排列顺序。3、蛋白质r的一级结构测定过程。,意 义：1、研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基础，这是因为Pr的一级结构决定了它的高级结构，从而决定了蛋白质的生物功能。2、一级结构的研究为生物进化提供了依据， 不同生物的同一种蛋白的其一级结构是不同的。3、一级结构的研究为一些分子病的诊断提供了依据。 只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复杂问题。,F. Sanger (19
10、51, Cambridge U) Insulin 胰岛素 (A, B chains),Nelson & Cox (2000) Principles of Biochemistry (3e) p.142,B-chain,A-chain,（二）、蛋白质一级结构的测定,阶段一：测序前的准备工作,1、蛋白质一级结构的测定程序,(1).确定蛋白质不同多肽链的数目 (2).拆分蛋白质分子的多肽链，打开蛋白质分子中的二硫键(3).分离纯化各自不同的多肽链(4).确定各多肽链的氨基酸组成,分离提纯蛋白质，测定蛋白质的分子量,阶段二：多肽链的测序,1、蛋白质一级结构的测定程序,(1).特异
11、性打断多肽链，产生适合测序大小的肽段(2).分离纯化肽段(3).确定每一肽段的氨基酸顺序(4).采用另一种特异性试剂将多肽链打断,重复前三步.,阶段三：氨基酸顺序的拼接,1、蛋白质一级结构的测定程序,(1).利用重叠拼接法拼接氨基酸顺序(2).确定多肽链之内和之间的二硫键的位置.,N-末端分析 A.化学法DNS-Cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。 DN
12、FB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等。PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。,2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定,N-末端分析 B.酶 法（氨肽酶法） 从多肽链的N-末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线。亮氨酸氨肽酶：最常用氨肽酶M：较常用,2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定,Gly-Ser-V
13、al,N-末端分析 C.常见问题及处理方法：,2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定,经常碰到N-末端残基的氨基被封闭。因此不能与Edman降解试剂发生作用。 焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。,焦谷氨酸氨肽酶, C-末端分析 A.肼解法 无水肼NH2NH2 100 5-10h。 &nb
14、sp; 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。 Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。,2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定, C-末端分析 B.还原法, 硼氢化锂(LiBH4)肽-COOH生成肽-CH2OH水解,分离,层析鉴定。此法比较少用。 C.羧肽酶法，（Pro不能测）,2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定,羧肽酶A：除P
15、ro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、Lys,ValSerGly,.多肽链之间的连接方式 A.共价键二硫键 -S-S-酰胺键 -CO-NH- 酯键
16、 -CO-O- B.非共价键氢键 RH离子键 R+R-疏水作用 R R范德华力
17、; R R,3、肽链的分离、纯化与测定,共价键或非共价键的键能,键 长 真空中 水溶液,共价键离子键氢 键范德华力,0.15 nm 0.25 nm0.30 nm0.35 nm,90 80 4 0.1,90 3 1 0.1,kcal/mole,.肽链的拆离方法 A.二硫键的拆离过甲酸氧化法和巯基化合物（巯基乙醇）还原法。 &
18、nbsp; B.非共价键的拆离8M 尿素或6M 盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散而成无规则的构象。 C.烷基化试剂保护 如碘乙酸保护还原-SH，防止重新氧化。,3、肽链的分离、纯化与测定,4、肽链的部分水解,拆链得到的多肽链一般是100-1000个氨基酸，需要将其切成小肽段，分别测定它们的顺序，最后连在一起。,1、裂解的部位要专一。2、裂解点要少，切的肽段的大小要合适。3、产率要高，要求试剂不能破坏裂解后的肽段。裂解的方法：化学法，酶学法,、化学裂解法 &n
19、bsp; A.溴化氰裂法：专一裂解Met羧基所成的肽键,4、肽链的部分水解,甲基硫氰酸,、化学裂解法 B.羟胺断裂：专一裂解Asn-Gly之间的肽键。,4、肽链的部分水解,专一不很强，Asn-Leu,Asn-Ala键也部分裂解由于Asn-Gly出现机率较低，所以所得片断较大。,、酶裂解法 A.胰蛋白酶( trypsin ),4、肽链的部分水解,专一裂解Lys、Arg的羧基参与形成的肽键。为了减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保护起来，1.2环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭Lys。氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。,B.糜蛋白酶(Chymotrypsin),断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽键。断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力，酸性：裂解能力,环已二酮,、酶裂解法 C.胃蛋白酶(Pepsin),4、肽链的部分水解,断裂键两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残基。其后和前为Pro时抑制。,D.嗜热菌蛋白酶(Thermolysin),
