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1、12013/10/29第五节 发酵培养基的设计培养基： 是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料。广义上讲，凡是支持微生物或动植物细胞生长和繁殖的介质或材料都可作为培养基的原料。22013/10/29一、培养基的类型依据 类型 特 点按营养物质的来源天然 异养微生物生长，一般自养型微生物不能生长合成 定量工作研究用，生长慢，营养成分简单半合成 大多数微生物均能生长、繁殖按培养基形态液体 培养种子和发酵时用固体 用于菌种分离、保藏、观察、计数、鉴定等半固体 液琼脂，微好氧细菌的培养或运动能力确定按生产用途斜面 供保藏菌种或产孢子用， C、 N（尤其有机氮
2、）浓度要适合种子 供摇瓶种子或生产用，半合成为主，营养丰富、完整发酵 供菌体生长繁殖和最大限度地获得目的产物用的按培养基功能选择 不妨碍目的 M生长，而抑制非目的 M生长鉴别 加营养物或化合物，将对象 M与其他 M区别培养基的基本要素：基本营养源、水、生长因子及发酵调节剂。（一）基本营养源1、碳源作用： 一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架；二是提供菌体合成目的产物的原料。常用的碳源： 糖类、油脂、有机酸、低碳醇等。二、发酵培养基的组成2、氮源作用： 组成菌体细胞结构物质、合成含氮代谢产物。常用的氮源有机氮 ： 黄豆 /棉子饼粉、玉米浆、蛋白胨和尿素等无机氮 ： 铵盐、
3、硝酸盐和氨水等。3、无机盐和微量元素作用： 构成菌体成分；作酶的组成或激活剂；调渗透压、pH、电位等。常用的无机盐和微量元素： P、 Mg、 S、 Fe、 Na、 Cl、Zn、 Co、 Mn等。（二）水1、作用： 良好溶剂，热导好；运输介质；维持 cell形态；水合、脱水作用2、常用的水源： 深井水、自来水及地表水3、水质的控制： pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量等（三）生长因子有机氮源是生长因子重要来源。（四）发酵调节剂1、前体： 指某些化合物在发酵过程中直接被微生物在生物合成时结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入该化合物有较大的提高
4、。2、产物合成促进剂和抑制剂： 指那些既非营养物质又不是前体，但加入后却能提高产物产量的添加物。青霉素：分子量 356 苯乙酸 :分子量 13672013/10/29三、发酵培养基的设计与优化（一）发酵培养基的设计原理（ 1）菌体的同化能力（ 2）培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响（ 3） C : N 对菌体代谢调节的重要性（ 4） pH对不同菌体代谢的影响82013/10/29（二）发酵培养基的 优化 方法（ 1）根据以前的 经验 以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题，初步确定 可能 的培养基组分；（ 2）通过 单因子优化 实验确定最为适宜的各个培养基 组分及其 最适浓度 ；（ 3）最后
5、通过 多因子 实验，进一步优化培养基的各种成分及其 最适浓度 。由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。正交试验正交试验设计方法，简称正交设计，是试验设计的重要组成部分。此法由日本的田口玄一于 1949年创立。正交试验设计方法是从全面试验中挑出部分有代表的点进行试验，这些代表点具有“均匀”和“整齐”的特点。正交试验设计是部分因子设计的主要方法，具有很高的效率。为提高某化工产品的转化率，选择了三个有关因素进行条件试验，反应温度 (A)，反应时间 (B)，用碱量 (C)，并确定了它们的试验范围。A： 80-90 B： 90-150分钟 C： 5-7试验目的是搞清因子 A、
6、B、 C对转化率有什么影响，哪些是主要的，哪些是次要的，从而确定最适生产条件，即温度、时间及用碱量各为多少才能使转化率高。试制定试验方案。一、正交实验简介这里，对因子 A，在试验范围内选了三个水平；因子 B和 C也都取三个水平：A： A1 80 ， A2 85 ， A3=90B： B1 90分， B2 120分， B3=150分C： C1 5， C2 6%， C3 7%当然，在正交试验设计中，因子可以是定量的，也可以是定性的。定量因子各水平间的距离可以相等，也可以不相等。这个三因子三水平的条件试验，通常有两种试验方法。方法一 : 全面试验法取三因子所有水平之间的组合，即 A1B1C
7、1， A1B1C2，A1B2C1， ， A3B3C3，共有 33=27次试验。用图表示就是图 1 立方体的 27个节点。这种试验法叫做 全面试验法。全面试验对各因子与指标间的关系剖析得比较清楚。但试验次数太多。特别是当因子数目多，每个因子的水平数目也多时，试验量大得惊人。如选六个因子，每个因子取五个水平时，欲做全面试验，则需 56 15625次试验，这实际上是不可能实现的。如果应用正交实验法，只做 25次试验就行了，而且在某种意义上讲，这 25次试验代表了 15625次试验。方法二 : 简单对比法变化一个因素而固定其他因素，如首先固定 B、 C于 B1、 C1，使 A变化之： A1
8、B1C1 A2 A3 (好结果 ) 如得出结果 A3最好，则固定 A于 A3， C还是 C1，使 B变化之 B1A3C1 B2 ( 好结果 ) B3得出结果以 B2为最好，则固定 B于 B2， A于 A3，使 C变化之 C1A3B2C2 ( 好结果 ) C3试验结果以 C2最好。于是就认为最好的工艺条件是 A3B2C2。这种方法也有一定的效果，但缺点很多。这种方法的选点代表性很差，如按上述方法进行试验，试验点完全分布在一个角上，而在一个很大的范围内没有选点。因此这种试验方法不全面，所选的工艺条件A3B2C2不一定是 27个组合中最好的。我们看到，在 9个平面中每个平面上都恰好有三个点而每个平面
9、的每行每列都有一个点，而且只有一个点，总共九个点。这样的试验方案，试验点的分布很均匀，试验次数也不多。正交试验设计的 基本特点 是： 用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。例如：要考察增稠剂用量、 pH值和杀菌温度对豆奶稳定性的影响。每个因素设置 3个水平进行试验 。A因素是增稠剂用量，设 A1、 A2、 A3 3个水平； B因素是 pH值，设 B1、 B2、 B3 3个水平； C因素为杀菌温度，设 C1、 C2、 C3 3个水平。这是一个 3因素 3水平的试验，各因素的水平之间全部可能组合有 27种 。二、正交实验设计如对于上述 3因素 3水平试验 ， 可利
10、用 正交表 L9(34)安排实验 ， 试验方案仅包含 9个水平组合 ， 就能反映试验方案包含 27个水平组合的全面试验的情况 ， 找出最佳的生产条件 。La（ bc）正交设计试验总次数，行数 因素水平数因素个数，列数等水平正交表 La（ bc）正交表表 10-2是一张正交表，记号为 L8(27)。其中“ L”代表正交表； L右下角的数字“ 8”表示有 8行 ，用这张正交表安排试验包含 8个处理 (水平组合 ) ；括号内的底数“ 2” 表示因素的水平数，括号内 2的指数“ 7”表示有 7列 ，用这张正交表最多可以安排 7个 2水平因素。常用的正交表已由数学工作者制定出来 ， 供进行正交设计时选用
11、 。2水平正交表除 L8(27)外 ， 还有 L4(23)、 L16(215)等；3水平正交表有 L9(34)、 L27(313) 等 （ 详见有关参考书 ） 。正交试验设计的基本程序正交试验设计的基本程序包括 试验方案设计 及 试验结果分析 两部分。明确试验目的与要求选定试验指标选因素、定水平因素、水平确定选择合适正交表表头设计列试验方案试验方案设计：试验结果分析进行试验，记录试验结果试验结果极差分析计算K值计算k值计算极差R绘制因素指标趋势图优水平 因素主次顺序优组合 结 论试验结果分析：试验结果方差分析列方差分析表，进行 F 检验计算各列偏差平方和、自由度分析检验结果，写出结论1、 试验
12、方案设计例： 为提高山楂原料的利用率，研究酶法液化工艺制造山楂原汁，拟通过正交试验来寻找酶法液化的最佳工艺条件。（ 1） 明确试验目的，确定试验指标对本试验而言，试验目的是为了提高山楂原料的利用率。所以可以以液化率 液化率 =(果肉重量 -液化后残渣重量)/果肉重量 100%为试验指标，来评价液化工艺条件的好坏。液化率越高，山楂原料利用率就越高。根据专业知识、以往的研究结论和经验，从影响试验指标的诸多因素中，通过因果分析筛选出需要考察的试验因素。 一般确定试验因素时，应以对试验指标影响大的因素、尚未考察过的因素、尚未完全掌握其规律的因素为先 。试验因素选定后，根据所掌握的信息资料和相关知识，确
13、定每个因素的水平，一般以 2-4个水平为宜 。对主要考察的试验因素，可以多取水平，但不宜过多（ 6），否则试验次数骤增。 因素的水平间距，应根据专业知识和已有的资料，尽可能把水平值取在理想区域。（ 2） 选因素、定水平，列因素水平表对本试验分析，影响山楂液化率的因素很多，如山楂品种、山楂果肉的破碎度、果肉加水量、原料 pH 值、果胶酶种类、加酶量、酶解温度、酶解时间等等。经全面考虑，最后确定 果肉加水量、加酶量、酶解温度和酶解时间 为本试验的试验因素，分别记作 A、 B、 C和 D，进行 四因素正交试验，各因素均取三个水平 ，因素水平表见表 10-3所示。水平试验因素加水量（ mL/100g）
14、A加酶量（ mL/100g）B酶解温度（ ）C酶解时间（ h）D1 10 1 20 1.52 50 4 35 2.53 90 7 50 3.510-3 因素水平表正交表的选择是正交试验设计的首要问题。 确定了因素及其水平后，根据因素、水平及需要考察的交互作用的多少来选择合适的正交表。 正交表的选择原则是在能够安排下试验因素的前提下，尽可能选用较小的正交表，以减少试验次数。一般情况下 ， 试验因素的 水平数应等于 正交表中的 水平数；因素个数 应不大于正交表的 列数 。（ 3） 选择合适的正交表此例有 4个 3水平因素 ， 可以选用 L9(34)或 L27(313) ；因本试验仅考察
15、四个因素对液化率的影响效果 ， 故 宜选用 L9（ 34） 正交表 。 若要考察交互作用 ， 则应选用 L27(313)。所谓表头设计，就是把试验因素分别安排到正交表的各列中去的过程。各因素可随机安排在各列上。此例中，可将加水量 (A)、加酶量 (B)和酶解温度 (C)、酶解时间（ D）依次安排在 L9(34)的第 1、 2、 3、 4列上，见表 10-4所示。（ 4） 表头设计列号 1 2 3 4因素 A B C D表 10-4 表头设计把正交表中安排各因素的列（不包含欲考察的交互作用列）中的每个水平数字换成该因素的实际水平值，便形成了正交试验方案（表 10-5）。（ 5）编制试验方案，按方
16、案进行试验，记录试验结果。试验号 因 素A B C D1 1 1 1 12 1 2 2 23 1 3 3 34 2 1 2 35 2 2 3 16 2 3 1 27 3 1 3 28 3 2 1 39 3 3 2 1表 10-5 试验方案及试验结果说明：试验号并非试验顺序，为了排除误差干扰，试验中可随机进行；安排试验方案时，部分因素的水平可采用随机安排。（ 10）（ 50）（ 90）（ 4）（ 7）（ 1）（ 35）（ 20）（ 50） (3.5)(2.5)(1.5)试验结果（液化率 %）0172412472811842Kjm， kjm计算简便，直观，简单易懂，是正交试验结果分析最常用方法。以上例为实例
