《ELISPOT技术原理及其操作》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ELISPOT技术原理及其操作（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ELISPOT 技术 在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response , CMI )也是人们所关注的,而 T 细胞在 CMI 中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研究方法可以使用，如：ELISA （酶标记免疫附测定法， enzyme-linked immunosorbent assay）、流式细胞分析术（flow cytometry ）、定量 RT-PCR以及这里要介绍的近年使用越来越多的 ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术酶联免疫斑点法(enzyme linked im
2、munospot assay, ELISPOT ) ,是从单细胞水平检测分泌抗体细胞( ASC) 或分泌细胞因子( CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌 CK 细胞检测或 ASC 测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。 原理 ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难，关于ELISA的工作原理可看 酶联免疫吸附实验（ELISA）【1】 。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理,通过酶的高催化 频率,放大反应效果,从而达到很
3、高敏感度的检测效果。 如图所示，反应步骤可大致分为： 1. 利用特定细胞因子的单克隆抗体 包被 96 孔板，封闭剩余的空白位点 2. 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合 3. 洗掉细胞 4. 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目 以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。 具体实验操作 从原理上看 ELISPOT 的确很简单，但是在操作过
4、程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下 ELISPOT 的操作步骤。 I. 将适量捕获性抗体预先包被于 96 孔 ELISPOT 板上,用胶带封板并在 4孵育过夜。将板用 PBS 洗 6 遍,再用含体积比 10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭,室温下孵育至少 1h。FCS 可以封闭所包被抗体的 FCS 受体以降低非特异性反应。有一种特殊的 96 孔板底面介质是 PVDF 膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF 膜的不透光性也是 ELISPOT与 ELISA 的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的
5、抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。 II. 将阴性对照和细胞样品,如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) ,经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC,用含 10%FCS的培养基稀释至 51042105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试 31055105个/孔，特别是在分泌细胞）,分装于ELISPOT板孔中,再加入特异的刺激物,如多肽或基因表达产物,提取的抗原等,阴性
6、对照孔中只加入培养 基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应）,阳性对照孔加入植物血凝素(PHA,2g/mL)或阳性多肽,37,体积比为 5% CO2培养 2448h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至 10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。 III.
7、 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次,以弃去细胞,加入生物素化抗细胞因子的检测抗体,孵育 3h。再洗 6 次后,加入 AP 或 HRP 标记的链亲和素,室温孵育 3h。 IV. 用 PBS-Tween-20 再洗 5 次,加入底物 室温下显色,待出现紫色(AKP 和底物的产物)或红色(HRP 和底物的产物)斑点时,即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数,并用斑点形成单位(sfu/L 百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌 CK 的细胞。若预先包被抗原,则可用于 ASC 测定,这时,每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。 完成了以上步骤后其实只是完成了
8、实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用 photoshop 进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同
9、位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使 ELISPOT 的应用范围更加扩宽。 技术优势： ELISPOT的历史可以追溯到 1963 年Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟,1983 年,Czerkinsk y等采用此法检测脾细胞中分泌
10、特异性抗体的细胞数,发现该方法敏感性高简便易行。后来,他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2的细胞数 。随后,用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子(如IL-2 , IL-4 , IL-5 , IL-10 , TNF和IL-6) 数量的手段也被建立起来。Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性, Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis ,CVIA) 自 动分析TNF2 酶联免疫斑点的大小和数量,计算与负载抗原肽 的靶细胞接触后外周血单核细胞(PBMC
11、) 中抗原特异性CD8+T细胞的数量,不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来,开发出类似的斑点计数系统,认为当每孔斑点数大于 100 时,这种方法更客观、可重复性高且节省时间。 随着 ELISPOT 技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举 ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。 与 ELISA ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系
12、统对斑点进行计数， 1 个斑点代表 1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率） 由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比 ELISA 更灵敏，能从 20 万-30 万细胞中检出 1 个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。 与有限稀释法（limiting dilution analysis , LDA） LDA 能够对特异性 CTL 细胞进行定量,曾在很多年中被认为是 CTL 检测的“金标准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性
13、 T 淋巴细胞(memorial CTL, mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激, 这会加快效应CTL(eCTL)凋亡,且不能定量测定 eCTL 细胞数量或测定值偏低。其次,该方法较繁琐,培养时间可长达 23 周，而且很容易造成 T 细胞数量损失。 与四聚体法（Tetramer） 最近几年出现了 MHC2类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强,即使当体内mCTL水平低于1%,用MHC2抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值,比 LDA 敏感度要高 510 倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定 MHC类分子的技术困难外,最主要缺点是表位的选择。
14、由于每次反应只能分析单一的抗原表位,而 MHC类分子结合的各种表位,能否形成 CTL 反应,却随着基因背景及时间的 变化而变化,因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过 Elispot 来进行,但对整个肽库进行扫描,并不是一件很容易的事。当然,生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时,有研究结果表明,并非所有经过 Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能, Tetramer 阳性的细胞数是用 ELISPOT 分析能分泌 INF2细胞数的 10 倍,其中很多是不表现功能的惰性细胞,可能代表了记忆型 CTL 前体细胞。Tetramer 分析只增加了分析的灵敏度,同时测定
15、其功能很重要。 与Cr51释放法 此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效,且能精确阐明被CTL识别的最佳表位,但至多为半定量的层面,而且Cr51标记细胞的自发释放率较高,不适于较长时间培养；标记时所需的细胞浓度较高,因而给试验带来诸多不便；此外,Cr51释放法所测定的是一个细胞群体的特性,而不是单个细胞。 与胞内 CK 染色法 与 ELISPOT 法相比较,胞内 CK 染色法(intra-cellular CK staining,ICS) 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数 的 FACS 法,是检测循环淋巴细胞中抗原特异性 T 淋巴细胞的可行方法,而 E
16、LISPOT 法却可以检测所有分泌 CK 的eCTL 。 应用 目前，ELISPOT 已被用于检测药物、化学制剂及其它 CK 复合物的特性及功能等方面,因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来, ELISPOT 技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。 在抗肿瘤免疫及相关领域中的应用 在许多研究中,该技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特异的细胞毒性T 细胞(CTL)的数量检测。近期,ELISPOT 技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC 中检测肽特异的 T 淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的 T 细胞的疫苗试验。 ELISPOT 检测 T 细胞反应时敏感性、特异性和可重复性都很高,操作简单迅速,需要少量标本,在检测抗原特异性细胞数量的同时也反应其功能,并与临床结果相关。ELISPOT 平板可以提前大量准备,移液、洗板和读板都可自动化,因而大批量检查也可做到快速高效。在与与其他方法的比较后,ELISPOT 很
