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1、 国家市场监督管理总局国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会国家标准化管理委员会 ICS 07.080 X 40 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T XXXXX202X 植物次生代谢产物大豆凝集素测定 酶联 免疫吸附法 Determination Determination for for soybean agglutininsoybean agglutinin of plant of plant secondarsecondary metabolitesy metabolites EnzymeEnzyme- -linked im
2、munosorbent assaylinked immunosorbent assay （征求意见稿） 202X-XX-XX 发布 202X-XX-XX 实施 发布 GB/T XXXXX 2012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位： 本标准主要起草人： GB/XX XXXXXX 1 植物次生代谢产物大豆凝集素测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了植物次生代谢产物大豆凝集素的酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于大豆及其制品中次生代谢产物大豆凝集素的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的
3、应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本 适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 植物激素类次生代谢产物 Secondary metabolites of plant hormones 在极低浓度下即可调节植物生理反应，调控植物生长、发育与分化的活性物质，包括调 节细胞伸长生长的生长素类活性物质， 促进细胞分裂生长的细胞分裂素类活性物质， 加速细 胞生长从而解除或抑制组织休眠、 衰老等过程的赤霉素类活性物质， 抑制细胞生长
4、从而促进 组织休眠、 脱落等过程的脱落酸类活性物质， 调节植物伸长生长及营养分配的油菜素内酯类 活性物质。 主要来自植物自身合成代谢产生的天然产物以及通过微生物发酵或人工合成获得 的活性功能类似物。 4 原理 本方法的测定是基于双抗夹心酶联免疫反应， 在微孔板中包被大豆凝聚素抗体 （一抗） ， 试样预处理后加入微孔中，试样中的大豆凝聚素与包被抗体结合，洗去未结合的其他成分， 加入特异性的酶标记抗体（二抗） ，再次洗去未结合的其他成分后，加入显色剂显色，终止 液终止反应，用酶标仪在450 nm处测定吸光度，吸光值与大豆凝聚素含量呈正相关，与代入 标准曲线即可得出大豆凝聚素的含量。 5 试剂和材料
5、 除注明外，所用化学试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 大豆凝集素检测试剂盒。 GB/XX XXXXXX 2 5.2 大豆凝集素：纯度大于等于 98%。 5.3 大豆凝集素溶液的配制：用 PBS 作为溶剂配制成 200 g/mL 的储备液，于- 4C 条件下保 存。 5.4 pH 值为 7.2 的样品稀释用磷酸盐缓冲液（PBS 缓冲液） ：分别称取 0.55 g 磷酸二氢钠 （NaH2PO4 H2O） ，2.85 g 磷酸氢二钠（Na2PO4 2H2O）和 9 g 氯化钠，用水溶解并定容至 1 L。 6 仪器和设备 6.1 天平：感量 0.01 g。 6.2 均质
6、器 6.3 涡旋混合器 6.4 微量移液枪 5 L-50 L，10 L -100 L，0 L-1000 L。 6.5 多通道微量移液枪：50 L-300 L。 6.6 容量瓶：10 mL，1000 mL。 6.7 酶标仪 6.8 粉碎机 6.9 离心机：5000 r/min。 7 试样的制备与保存 7.1 试样的制备 7.1.1 固态样品：将抽取的样品混匀，用搅拌器搅拌至粉末状，过 20 目筛网，装入清洁的容 器内，作为试样。密封，并标明。 7.1.2：液态样品： 涡旋混合器混匀所抽取样品，均分到另外两个样品容器中，作为试样。 密封，并标明。 7.1.3： 半固态样品：用均质机混合抽取的样品，
7、以使所有的独立物质能完全分散开。边摇 边用勺或大口吸管均分到另外两个样品容器中，作为试样。密封，并标明。 7.2 试样的保存 GB/XX XXXXXX 3 将试样于 4C 以下避光保存。 8 分析步骤 8.1 提取 8.1.1 固态样品： 称取 1 g（精确到 0.01 g）过筛的样品粉末，加入到 10 mL 的浸提液（PBS 缓冲液）中，恒温水浴锅中超声波处理 40 min，在 32提取 6 h，之后于 3 000 r/min 离心 15 min， 弃去沉淀， 取上清液至离心管中 3 000 r/min， 再离心 20 min， 得到上清液保藏于 4 。 8.1.2 液态样品：准确量取1 m
8、L 待测样品加入到10mL 的浸提液（PBS缓冲液）中，恒温水 浴锅中超声波处理40 min，在32提取 6 h，之后于3 000 r/min离心15 min，弃去沉淀，取 上清液至离心管中3 000 r/min，再离心20 min，得到上清液保藏于4 。 8.1.3 半固态样品：将样品混匀，准确称取1 g （精确到0.01 g）匀浆样品，加入到10 mL 的 浸提液 （PBS缓冲液） 中， 恒温水浴锅中超声波处理40 min， 在32提取6 h， 之后于3 000 r/min 离心15 min，弃去沉淀，取上清液至离心管中3 000 r/min，再离心20 min，得到上清液保藏 于4 。
9、8.2 稀释 将上述样品稀释合适倍数检测。 高浓度的样品， 大豆凝集素含量如超出标准曲线线形范 围，可进一步稀释，直至样品中大豆凝集素浓度在标准曲线范围以内。最终取50 L样品上 清液进行酶联免疫测定。 8.2 测定条件 8.2.1 操作条件：所有操作应在室温下（2024）进行，大豆凝集素试剂盒中所有试剂的 温度均应回升至室温（2024）后方可使用。 8.2.2 孵育条件：37 烘箱中避光孵育。 8.2.3 洗板条件：人工洗涤次数3次以上，每次加入洗涤液量为 250 L，自动洗板可以预定 7次。 8.2.4 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。 8.3 测定步骤 8.3.1 将测定需
10、用的微孔条插入微孔架，吸取100 L 梯度标准液和样液至各微孔，并记录 标准液和样液在微孔架上的位置，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，放入37 烘箱中孵 育1 h。 8.3.2 倒出孔中液体，以 250 L 洗液反复清洗微孔，重复操作3次以上，将微孔倒置在吸 GB/XX XXXXXX 4 水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。 8.3.3 洗板三次拍干后， 用抗体稀释液将标记HRP的单抗稀释到2 g/mL加入酶标板， 100 L/ 孔，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，放入37 烘箱中孵育1h。 8.3.4 按8.3.2 方法洗板后，在酶标板中加入新鲜配制的TMB显色液，37避光反应15 m
11、in。 8.3.5 孵育完毕后加入50 L终止液至各微孔，充分混匀，酶标仪测量并记录每个微孔试液 450nm 波长处的吸光度值（加入反应终止液后应在30 min内读取吸光度） 。 8.4 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 8.5 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 8.6 阳性质控 每次测定均应做一个添加自配大豆凝集素标准品溶液的监控样品。 以确定实验过程的操 作准确性。 9 结果计算 以吸光值为纵坐标，以大豆凝集素标准品溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制出标准工 作曲线。从标准曲线上得出试样相应的大豆凝集素的浓度后，结果按式（1）进行计算：
12、 （1） 式中： X样品中凝集素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ； c从标准工作曲线上得到的样品中凝集素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL） ； V样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL） ； a样品溶液的最终稀释倍数； m样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g） 。 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。 注：计算结果扣除空白值，所得结果保留两位小数。 10 方法的评估 GB/XX XXXXXX 5 10.1 标准曲线线性 以标准溶液考察线性和范围。标准曲线为Y-lg(X)等数学模型计算时，在试剂盒规定的 浓度范围内，其线性相关系数的绝对值应0.99。 10.2 方法的检测
13、限LOD和定量限LQD 20次空白样的检测值的平均值； SD20次空白样的检测值的标准偏差。 10.3 精密度 10.3.1 批内变异系数：采用同一批次的大豆凝聚素SBA试剂盒，在同一实验室，由统一实验 人员对浓度为1000 ng/mL的SBA进行10次独立测试 (n=10)，验证测试结果之间的一致程度。 变异系数小于15%。 10.3.2 批间变异系数：采用10个不同批次的SBA试剂盒（n=10） ，对浓度为1000 ng/mL的SBA 进行独立测试，验证测试结果之间的一致程度。变异系数小于20%。 10.4 方法的添加回收率 分别在以约LOD，5倍LOD和10倍LOD进行空白添加实验，样本的回收率不得低于60%， 不得高于120%。 _
