透射电子显微镜(2)精编版

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1、透射电子显微镜 （Transmission Electron Microscope TEM） TEM具有和光镜相似的结构系统,由电子枪产生的电子射线作为光源 ,由电磁透镜代替光镜中用玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜 TEM 镜体结构相当复杂，镜筒内部要求高真空状态,第一节 透射电镜结构和工作原理 一、透射电镜结构 二、透射电镜工作原理 第二节 透射电镜样品制备技术 一、超薄切片技术 二、特殊组织样品制备,第一节 透射电镜的结构和工作原理 照明系统：电子枪、会聚透镜 镜筒成像系统：样品室、物镜、中间镜、投影镜 观察记录系统：观察室、底片室 真空系统：机械泵、油扩散泵、真空管等 辅助电源系统：高压电源

2、、透镜电源、调压器等 水冷系统：循环水泵等,一、透射电镜的基本结构,（一）电子束与电磁透镜 电子束在真空中运动的速度与加速电压有关（阳极）加速电压越高，电子束的波长越短(根据光学阿贝公式原理，一台仪器的成像最高分辨率，约为它使用信息传递媒介波长的一半。电镜之所以能获得很高的成像分辨率，是由于它的电子束波长远较可见光的波长为短） 电磁透镜的焦距与磁场（线圈组成，当电流通过时产生磁场）强度有关,磁场越强，焦距越短，放大倍率越高,二 、透射电镜的工作原理,（二）电镜图像形成 任何物质都是由原子组成的， 当均匀的电子束穿过样品时会受到 样品上信息的处理多数电子可从原 子和原子之间的空隙穿过，极少部 分

3、电子与原子核和轨道电子发生碰 撞而形成散射电子 散射电子能力强的地方透过电子数目少 打在荧光屏上所发出的光弱，显现为暗区 散射电子能力弱的地方透过电子数目多 打在荧光屏上所发出的光强 显现为亮区 样品结构不同散射电子的能力不同，结果？,第二节 透射电镜样品制备技术 一、常规样品制备技术 超薄切片技术 负染技术 二、特殊样品制备技术 电镜酶细胞化学技术 免疫电镜技术 电镜原位杂交技术等,普通光镜切片厚度约5m左右 石蜡切片 透射电镜切片厚度在50nm左右 超薄切片 （100nm以下） 目前有关生物体的各种组织、细胞的形态结 构知识大部分是超薄切片技术所提供,一 、超薄切片制备技术,取 材 预固定

4、 后固定 脱 水 浸 透 包 埋 修 块 切 片 染 色,超薄切片技术的基本操作程序,快 尽量保持其生活状态，在1分钟内固定 小 1mm的小块 轻 不要牵拉、锯、挤压组织 冷 4保存,（一）取材,1、固定目的 把在活体状态时的结构尽可能 完整保存下来 2、常用固定剂 戊二醛（ glutaraldehyde ） 对糖原、糖蛋白、尤其是微管、内质网 细胞基质有较好的固定作用 四氧化锇( osmium tetroxide,OSO4 ) 对含蛋白质、脂肪性物质有良好的固定作用 特别对磷脂蛋白膜的结构有良好的保存作用,（二）固定, 高锰酸钾 ( potassium permangauate ) 对磷脂蛋

5、白类有特别良好的固定作用 尤其对神经髓脂质的保护更为显著 甲醛（formaldehyde） 对酶活性的保存却优于戊二醛 在电镜细胞化学中常采用,3 固定方式 组织块浸泡固定 取数块1mm的组织块迅速浸泡于固定液中 体内原位固定 适用于动物实验，将动物麻醉解剖，暴露所 需的组织或器官，立即用预冷的戊二醛滴到 上面直到组织适度变硬，再取数块组织固定 灌流固定 多用于脑、肾赃、视网膜和睾丸等组织 将固定液经血液循环灌流到动物体内,把 活细胞在原位及时固定,指将样品内所含的游离水分完全清除的过程 (常用的脱水剂为乙醇和丙酮) 50%乙醇 1015分钟 4 70%乙醇 1015分钟 4 80%乙醇 10

6、15分钟 4 90%乙醇 1015分钟 4 100%乙醇 3次，每次10分钟，室温,（三）脱水,经脱水处理的样品，即可用包埋剂进行浸透 浸透 利用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂 使细胞内外所有空隙都被包埋剂填充 包埋 浸透好的样品块放入灌满包埋剂的胶 囊或适当的模具中经过紫外线照射或 加温聚合，即可制成包埋块 包埋剂 环氧树脂618 、 Epon812 Lowiscryl K4M低温树酯包埋剂,（四）浸透与包埋,（半薄切片的意义： 1、选取超薄切片的部位 超薄切片的面积一般要小于0.5mm2，要经过半薄切片选取有意义的部位（对肾脏、胰腺、脑、肌组织等更重要） 2、对同一部位进行光、电镜对比观察

7、通过半薄切片可以在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系。,五、半薄切片,热膨胀推进式切片机 利用金属杆加热产生的 微小长度变化提供进给 机械推进式切片机 用微动螺旋和微动杠杆 来提供微小进给,超薄切片机( Ultrotome ),六、超薄切片, 安装包埋块、安装玻璃刀、调整包埋块和刀的距离、调节水槽高度与灯光的位置、调节水槽液面、选择切片速度及进给厚度、片子切出后，漂浮在水槽的液面上，经展片后捞到载网上 判断切片厚度：一般利用切片表面反射的光和从切片下面反射光发生干涉所产生的干涉色为依据不同厚度的切片在显微镜下呈现不同的干涉色 灰 色 40

8、-50nm 银灰色 50-70nm 金黄色 70-90nm 紫 色 90nm以上,切片操作,电镜图像反差是由于电子束经过样品时电子散射程度不同产生的 散射的电子数越多，图像越？ 散射的电子数越少，图像越？ 重金属化合物有较强的电子散射能力,所以 经过重金属染色的样品呈现较强反差,七、电子染色,常用的染色剂有醋酸铀和枸橼酸铅 醋酸铀（Uranyl acetate） 能与细胞内多种成分结合，尤其对核酸 核蛋白等有较强的结合能力 枸橼酸铅(lead citrate) 能提高细胞膜系统及其脂类的反差,(一) 骨组织样品制备方法 （二）培养细胞样品制备方法 （三）血细胞样品制备方法 （四）石蜡包埋样品转

9、制方法,二 、几种特殊组织的样品制备方法,1. 将新鲜骨组织锯成23mm厚的骨片，立即投 入固定液中24小时（4）。 2. 漂洗后投入脱钙液中在室温或4下进行脱 钙（正常密质骨脱钙时间一般为3-4周，松 质骨为7-10天，4脱钙时间应适当延长） 3. 脱钙后再将样品修成1mm3大小，然后充分浸 泡，再按常规方法进入后固定、脱水、浸透 包埋、半薄、超薄切片和电子染色。,(一) 骨组织样品制备方法,脱钙液配制,乙二胺四乙酸二钠 40-50g 双蒸馏水 500ml 0.2mol/L NaOH 350ml 双蒸馏水加至 1000ml,1、将培养瓶内的培养液倒掉，加入预冷的 2.5%戊二醛固定 2、用橡

10、皮刮子将全部细胞从管壁上轻轻刮 下，收集在离心管内离心（2000转/分） 15-20分钟 3、弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花 纸包裹起来，然后进行漂洗等后面的程序,二、 培养细胞样品制备方法,负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研究工作,又称阴性染色，指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小,三、 负染色技术 (Negative）,当把有些重金属的盐溶液与生物材料的悬浮液混合以后，重金属的盐类不是被样品成分所吸收，而是沉淀到样品四周 如果样品具有高低不平表面结构，染液还能穿透进表面的凹

11、陷部分。这样在重金属元素沉淀的地方，散射电子的能力增强，因而样品四周表现为暗区，而在有样品的地方散射电子能力弱，因而表现为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来 目前，对其染色原理还不十分清楚，有密度反差原理和异常反差原理二种观点。,（一）负染技术的原理,1.染色液 目前最常用的为磷钨酸（Phosohotungstate） 配制成2-4%磷钨酸水溶液 磷钨酸的密度约为4，而生物标本的密度为1 外周染料密度与标本密度相差4倍 直径很小的物体可被清晰地显现出来 2.染色方法 负染色所用的样品全部取自悬浮液 将带有样品的悬液，滴于有支持膜的铜网上，静止数分钟后滴上染液数秒钟到2分钟，随后

12、进行电镜观察,（二） 负染样品的制备,第三章 重点,电子枪发射电子经会聚透镜会聚成电子束投射在样品上，电子直接穿透样品产生透射电子，透射电子带有样品信息，经成像系统放大投射到观察室的荧光屏上，荧光屏将电子影象转化为可见光影象以供使用者观察 透过的电子多荧光屏亮，反之荧光屏暗，荧 光屏的亮、暗程度与样品微细结构一一对应，最 终产生具有一定反差的黑白影像,一、透射电镜工作原理,LM TEM 照明源 光线 电子 分辨率 0.2m 0.1nm 放 大 1000 150万 透 镜 玻璃 磁透镜 应 用 显微水平 亚显微水平,二、光镜和电镜比较比较,快 尽量保持其生活状态，在1分钟内固定 小 1mm的小块

13、 轻 不要牵拉、锯、挤压组织 冷 4保存 取材固定脱水浸透包埋切片染色,三、取材要领,四、超薄切片程序,又称阴性染色，指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小.主要用于细菌、病毒等的研究 1.选取超薄切片的部位(定位) 2.对同一部位进行光、电镜对比观察,五、 负染色,六、半薄切片的意义,1、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。20.8.1820.8.18Tuesday, August 18, 2020 2、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。08:46:3808:46:3808:468/18/2020 8:46:38 AM 3、越是

14、没有本领的就越加自命不凡。20.8.1808:46:3808:46Aug-2018-Aug-20 4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。08:46:3808:46:3808:46Tuesday, August 18, 2020 5、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。20.8.1820.8.1808:46:3808:46:38August 18, 2020 6、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。2020年8月18日星期二上午8时46分38秒08:46:3820.8.18 7、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。2020年8月上午8时46分20.8.1808:46August

15、18, 2020 8、业余生活要有意义，不要越轨。2020年8月18日星期二8时46分38秒08:46:3818 August 2020 9、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。上午8时46分38秒上午8时46分08:46:3820.8.18 10、你要做多大的事情，就该承受多大的压力。8/18/2020 8:46:38 AM08:46:382020/8/18 11、自己要先看得起自己，别人才会看得起你。8/18/2020 8:46 AM8/18/2020 8:46 AM20.8.1820.8.18 12、这一秒不放弃，下一秒就会有希望。18-Aug-2018 August 202020.8.18 13、无论才能知识多么卓著，如果缺乏热情，则无异纸上画饼充饥，无补于事。Tuesday, August 18, 202018-Aug-2020.8.18 14、我只是自己不放过自己而已，现在我不会再逼自己眷恋了。20.8.1808:46:3818 August 202008:46,谢谢大家,