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1、Western blot 实验技术,定义:,印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支
2、持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液: 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 , 0.05% PMSF , 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin , pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中
3、非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的制备,蛋白样品的定量,Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式,在一定浓度的乙醇和酸性条件下,可配成淡红色的溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 试剂:考马斯亮蓝工作液,0.1N盐酸,双蒸水,蛋白标准液( 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.
4、5mg/ml。),SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理: SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 T
5、EMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,转膜,半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间,电转1030min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸泡在转移装 置的缓冲液中,电转45min或过夜。,转膜后检测,丽春红S染色 蛋白带出现后,于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜,换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。,封闭,脱脂奶粉(5) BSA Western Blot 膜封闭液(生物试剂公司提供),一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,根据滤膜
6、面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时,4 过夜。 倒掉一抗溶液,用PBS漂洗液滤膜3次,每次10min。 加入用封闭液配制的二抗,摇床上缓慢摇动, 37一小时,4 过夜。 倒掉一抗溶液,用PBS漂洗液滤膜3次,每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法(HRP) 碱性磷酸酶法(AP) 化学发光显色法(HRP),Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平? 凝胶漏液?,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀 温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,条
7、带比正常的窄? “微笑”或“倒微笑”条带?,凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓 拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲? 条带歪斜或漂移? 单个或多个白点? 转膜缓冲液过热?,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,