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1、目的基因 PCR 扩增产物的克隆 实验原理 1.PCR 产物回收 在高离子盐存在的情况下，DNA 片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列 快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐， 高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净DNA 从硅基质膜上洗脱。 2.T 载体与 PCR 产物的连接 源 DNA 与载体分子的连接就是DNA 重组，这样重新组合的DNA 叫做重组体或重组子。重组 的 DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切 的载体分子与外源DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体
2、 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性， 即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4 噬菌体 DNA 连接 酶浓度或增加DNA 浓度来提高平末端的连接效率。T4 噬菌体 DNA 连接酶催化DNA 连接反应分 为 3 步：首先， T4 DNA 连接酶与辅因子ATP 形成酶 -ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合 到具有 5磷酸基和3羟基切口的DNA 上， 使 DNA 腺苷化；
3、最后产生一个新的磷酸二酯键，把 切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA 片断有两个端点，所以切割时 出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。 对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的 自连接产物。 为了减少自环的高本底，可对载体进行5除磷酸处理， 原理是连接酶只能连接DNA 片断的 3 OH 末端与 5端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提 供 5端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双 酶切来说，无论载体与供体同一片
4、段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有 效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳 定的。因此采取折中的温度，即12- 16 ，连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接 酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR 产物，其 DNA 双链前后末端 都有一个游离的A 碱基，可以与T -Vector 末端游离的T 碱基互补形成环状重组T 质粒。 实验材料、试剂和仪器 PCR 扩增相关试剂、PCR 仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳
5、系统、凝胶成像系统、 PCR 产物回收试剂盒、pUCm-T载体。 实验步骤 1 PCR 扩增 PCR 反应体系： 注：每组做5 管，其中4 管用于 PCR 产物回收， 1 管作电泳检测时的对照 PCR 反应程序： 10 PCR Buffer2.5 l dNTPs 0.5 l Taq 0.2 l 引物 1 1.5 l 引物 2 1.5 l ddH20 17.3 l DNA 模板1.5 l 2目的基因PCR 扩增产物的琼脂糖电泳检测 （1）制备琼脂糖凝胶 称取 0.2g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20ml 1.0 TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全 溶化，取出摇匀，则为1% 琼脂糖凝胶液。 （
6、2）取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严， 不能留缝隙）。 （3）将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 （4）将冷到 60 左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层 均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 （5）待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。 （6）加入电泳缓冲液至电泳槽中。 （7）用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA 样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。 1 94 预变性5min 2 94 变性45s 3 60 退火30s 4 72 延伸60s 24 步骤， 35 循环 5 72 延伸10min 6
7、4保存 （8）接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA 片段从负极向正极移动）。DNA 的迁 移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm 。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止 电泳。 3产物回收 （1）在紫外光下将琼脂糖凝胶上的目的片段切下，放入1.5 mL Eppendorf离心管中；加入 500 l溶胶 /结合液 DB ，充分混匀。 （2） 将上一步所得溶液加入吸附柱AC 中 （吸附柱放入收集管中）， 室温放置1 min ， 12000rpm 离心 30-60s ，倒掉收集管中的废液。 （3）加入 700 l漂洗液 WB ，12000rpm离心 1min ，弃掉废液。 （4
8、）加入 500 l 漂洗液 WB ，12000rpm离心 1 min ，弃掉废液。 （5）将吸附柱AC 放回空收集管中，12000rpm离心 2 min ，尽量除去漂洗液，以免漂洗液 中残留乙醇抑制下游反应。 （6）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50 l洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65- 70 水浴中加热效果更好），室温放置2 min ，12000rpm离心 1 min 。 如果需要较多量DNA ，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱，离心1 min 。 4 PCR 产物与 T 载体的连接 对于常规的DNA ligase连接反应，请参考下面的连接反应体系，或按D
9、NA ligase的说明书 进行操作。每个连接反应使用1 l pMD 18-T载体，约 0.2pmol PCR产物，在10l 连接体系中 4连接过夜或室温连接1h 。 T4 DNA Ligase Buffer(2X) 5l Purified PCR Product 1l pMD 18-T Vector 1l T4 DNA Ligase (5-10U/微升 ) 1l ddH2O up to 10 l 5. 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法 ) 挑取新鲜的E.coli.DH5 单菌落接种于一个含有10 ml LB液体培养基（不含抗生素）的试 管中，于 37 恒温振荡（ 200 rpm）培养约4h
10、(OD=0.20.4)，取出后立即将其冰浴10min 。 在无菌条件下将冰浴后的菌液吸取1ml 到冰冷的1.5ml 无菌离心管中，于4下 10000g 离心 1min ，回收细菌。 每管中加入500 l于 4下预冷的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min ，于 4下 10000g离心 1min ，回收细菌沉淀物。 每管加入200 l冰预冷的CaCl2，混匀即为感受态细胞，置4冰箱备用。 6. 重组质粒转化大肠杆菌 取 10 l连接产物， 加入内装100 l感受态细胞的离心管中，轻弹管壁混匀， 冰浴 30 min 。 42 热击90s 后，迅速将离心管冰浴35min。 加入 1 ml 不含抗生素的L
11、B 液体培养基，混匀，于37 下振荡培养（ 180 rpm ）45 min 。 4 下， 10000 g ，离心 1 min ，吸出 500 l上清液弃去，再混匀，取200 l涂布于含有 100 g/ml 氨苄青霉素的LB 培养基平板上（事先涂布4l 浓度为 200 mg/mg IPTG和 20 l浓度 为 40 mg/ml X-gal），待菌液被培养基完全吸收后，倒置平板于37 培养 1216h，直至出现单 菌落。再将培养皿置于4，使其完全显色（即出现蓝、白斑）。 连接产物转化实验的同时，以等体积的ddH2O 代替连接产物， 其操作同上， 分别涂布于含 抗生素和不含抗生素的LB 平板上，分别作为阴性对照和阳性对照。 7. 重组子克隆的鉴定（本部分视实验进程而定） 挑取可能含有目的片段的白斑，接种到5 ml LB/Amp液体培养基中，37 220 rpm摇床培 养过夜。采用碱裂解法小量提取菌液质粒DNA ，进行 PCR 扩增，检测PCR 产物是否连接到载体 中。 附： TBE 电泳缓冲液的配制 5 TBE（ 5 倍体积的 TBE 贮存液） 配 1000ml 5 TBE： Tris 54g 硼酸27.5g 0.5mol/l EDTA 20ml （pH 8.0 ）
