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1、第一章基因工程,第一章基因工程,第一节基因工程概述,第一章基因工程,学习导航 1.简述基因工程的概念。（重点） 2.举例说出基因工程的工具。（重难点） 3.简述基因工程的一般过程与技术。（重难点）,一、理论与技术 1.理论基础：艾弗里证明了_是遗传物质；沃森和克里克阐明了DNA分子的_结构；尼伦贝格等破译了_。,DNA,双螺旋,遗传密码,2.技术 (1)工具酶：和_。 (2)载体：_等。 二、基因工程 1.概念：在_通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行_，然后导入_，并使_在受体细胞中表达，产生人类需要的_的技术。,DNA连接酶,质粒,体外,改造和,重新组合,受体细胞,重组基因,
2、基因产物,2.操作水平：_水平。 3.过程：基因_、体外_转移以及在受体细胞内的_等。,基因,分离,重组,复制和表达,想一想 人工“剪切”和“拼接”的结构基础是什么？ 提示：DNA的双螺旋结构。,三、酶与载体 1.限制性核酸内切酶 (1)只能识别_序列。 (2)在合适的反应条件下使_条链_的2个核苷酸之间的_键断裂。 (3)切割出_末端。,特定的核苷酸,每,特定,部位,磷酸二酯,黏性或平口,2.DNA连接酶 连接_个DNA片段形成两个_键成为一个重组DNA。 3.载体 (1)常见的载体有_、_以及一些动、植物_。 (2)最简单的质粒载体必须包含三个部分：_、_和_。,两,磷酸二酯,质粒,噬菌体
3、,病毒,复制区,遗传标记基因,目的基因插入位点,判一判 (1)限制性核酸内切酶能够破坏所有磷酸二酯键() (2)DNA连接酶通过形成磷酸二酯键连接黏性末端或平口末端() (3)质粒的目的基因插入位点含有DNA连接酶识别的序列(),基因文库,PCR,同一种,重组,目的基因,受体,标记基因,克隆,目的基因,工具酶,1.限制性核酸内切酶的识别与切割 (1)限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并有特定的切割位点。 (2)限制性核酸内切酶切开的末端是黏性末端或平口末端。,限制性核酸内切酶所识别的DNA序列，无论是6个碱基还是4、5、8个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基
4、是反向对称重复排列的。 若限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线的两侧分别切割，则得到黏性末端；若限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线处进行切割，则得到平口末端。,(3)在切割位点处破坏了磷酸二酯键。 (4)不同的限制性核酸内切酶可以切割相同的黏性末端。 (5)限制性核酸内切酶一般存在于原核生物的细胞内，能够切断外源DNA。,2.DNA连接酶 (1)连接两个DNA片段。 (2)形成磷酸二酯键。 (3)黏性末端能够形成碱基互补配对。 (4)DNA连接酶和DNA聚合酶的比较,特别提醒 (1)不同的限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同，切割位点不同，体现了酶的特异性。 (2)线性DNA没有切割前有两个
5、游离的磷酸基团，切割后有四个游离的磷酸基团。,(2012扬州中学高二调考)下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点。如图,已知某DNA在目的基因的两端1、2、3、4四处有BamH或EcoR或Pst的酶切位点。现用BamH和EcoR两种酶同时切割该DNA片段(假设所用的酶均可将识别位点完全切开)，下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的是(),A1 为EcoR，2为BamH，3为BamH，4为Pst B1 为BamH，2为EcoR，3为BamH，4为Pst C1 为Pst，2为EcoR，3为EcoR，4为BamH D1 为BamH，2为EcoR，3
6、为Pst，4为EcoR,【思路点拨】切割目的基因的两种限制性核酸内切酶切出的黏性末端不相同就不会发生自身环化。 【解析】现用BamH和EcoR两种酶同时切割该DNA片段获得目的基因，则2或3一定一个是BamH切割，另一个是EcoR切割，两种限制性核酸内切酶切割出的黏性末端不相同，目的基因不会发生自身环化。,变式训练 1.限制性核酸内切酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是() A在相同的DNA分子 中a酶的识别位点一般 明显要比b酶多 B能被a酶识别并切割的序列也能被b切割,Ca酶与b酶切断的化学键相同 D将大量a酶和b酶切割后的片段混合，重新连接后的DNA片段不一定全都能
7、被b切割,解析：选B。比较a酶和b酶的识别序列发现, b酶识别和切割的序列，a酶一定能够识别和切割；但是a酶识别和切割的序列，b酶不一定能够识别和切割。,质粒与重组质粒,1.质粒 (1)结构：环状DNA。 (2)分布：原核细胞的细胞质。 (3)能够作为载体的质粒组成： 复制区：含有复制原点，是DNA复制特定的起始位点。含有A/T碱基对较多。,遗传标记基因：主要是抗性基因，最常见的是抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因和新霉素抗性基因等。用于鉴定和筛选重组DNA分子。 目的基因插入位点：是某种限制性核酸内切酶的切割位点，便于目的基因的插入。通常一个质粒上会含有多种
8、限制性核酸内切酶的切割位点。,2.重组质粒 (1)由质粒和目的基因组成。又叫重组DNA分子。 (2)在体外操作。 (3)需要利用限制性 核酸内切酶和DNA连接酶。,(4)结构分析： 和质粒相比较多出一个目的基因结构。 启动子和终止子控制目的基因的转录。 a启动子上有RNA聚合酶识别和结合的位点，启动目的基因的转录。 b终止子，RNA聚合酶不能与之结合，终止转录。,特别提醒 (1)质粒能够在宿主细胞内稳定存在。 (2)小分子质粒易于操作和分离纯化。,(2012江都高二期末)科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特
9、定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GGATCC ，限制性核酸内切酶的识别序列和切点是 GATC ，据图回答：,(1)由上述质粒结构图可知基因工程中的载体至少应具备的条件是_； _,(2)根据图示分析，在构建基因表达载体过程中，应选用限制性核酸内切酶_(填“”或“”)切割质粒，再用_缝合目的基因和质粒之间的缺口，可获得_种重组质粒。,(3)将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有_的培养基上，待平板冷凝后为避免污染，需将培养皿呈_状态放置。经过一定时间培养后，能够在培养基上生长的，说明已导入了_，反之则没有导入。,【解析】(1)从图中可以看出质
10、粒的结构特点是有两个标记基因分别是氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，并且有两种限制性核酸内切酶的切割位点，其中酶切割位点有一个，酶的切割位点有两个。 (2)如果使用酶切割质粒，在两个抗性基因上都有切割位点,质粒的抗性基因被破坏,所以不能用酶切割质粒,只能用酶切割,保留一个氨苄青霉素抗性基因；对于目的基因的获取则不能使用酶切割，只有使用酶切割含有目的基因的DNA。由于两种酶的黏性末端相同,所以在DNA连接酶的作用下目的基因和切割的质粒的黏性末端能够形成碱基互补配对。由于质粒只有一个切口,所以目的基因和质粒只能形成一种重组质粒.,(3)将目的基因导入大肠杆菌的结果有三种,没有导入任何结构的大肠杆
11、菌，导入插入目的基因的质粒的大肠杆菌和导入没有插入目标基因的质粒的大肠杆菌，由于都含有氨苄青霉素抗性基因，所以能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长。 接种微生物后的培养采用倒置培养皿的方式能够防止凝结在皿盖上的水蒸气流到培养基表面污染菌种；有利于菌种利用培养基营养,加快生长速度。,【答案】(1)含标记基因有一个或多个限制性核酸内切酶切割位点 (2)DNA连接酶1 (3)氨苄青霉素倒置普通质粒或重组质粒(写一个不给分),【探规寻律】(1)当质粒有多个限制性核酸内切酶切割位点时，要分清切割后是否还存在抗性基因等标记基因。 (2)限制性核酸内切酶要切割完整的目的基因，不能破坏目的基因的结构。 (3)不
12、同的限制性核酸内切酶切割要注意黏性末端能否碱基互补配对。,变式训练 2.(2012南京师大附中高二月考)下图为重组质粒形成示意图。将此重组质粒导入大肠杆菌,然后将大肠杆菌放在四种培养基中培养：a无抗生素的培养基，b含四环素的培养基，c含氨苄青霉素的培养基，d含四环素和氨苄青霉素的培养基。含重组质粒的大肠杆菌能生长的是(),Aa Ba和c Ca和b Db和c,解析：选B。从图中可以看出人的生长激素基因插入到抗四环素基因中，导致抗四环素基因结构被破坏，无法表达，重组质粒只有抗氨苄青霉素基因能够表达，导入此重组质粒的大肠杆菌只能够在无抗生素或含有氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含有四环素的培养基上生
13、长。,1.目的基因获取 (1)从基因文库中获取 基因文库的构建：切割某一种生物细胞的整个基因组DNA成为大小合适的片段构建重组质粒分别导入宿主细胞宿主细胞繁殖成群成为基因文库(扩增DNA片段),基因工程的操作技术,特点：包含了某种生物细胞的全部基因。 获取目的基因的方法： 根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物和翻译产物等信息，可直接从基因文库中获得目的基因。,(2)PCR技术扩增目的基因 原理：DNA复制。 过程：变性退火延伸,与细胞内DNA复制不同点：解旋不需要解旋酶、需要引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、快速大量复制。 目的基因循环扩增的结果：后代分为
14、三种情况，一个只含有引物A的目的片段，一个只含有引物B的目的片段， 2n2个同时含有引物A和B的目的片段。,特别提醒 PCR技术过程所需能量来自热能，细胞内DNA复制所需能量来ATP水解。,2.制备重组DNA分子基因工程的核心 (1)目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在； 能够遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。,(2)基因表达载体的结构：由启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点组成。 启动子：在目的基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动目的基因的转录。 终止子：在目的基因的下游，终止目的基因的转录。,3.转化受体细胞：将携带目的基因的载体导入受体细胞。 当受体细胞为
15、微生物细胞时，常用CaCl2处理微生物细胞，以增大细胞壁的通透性，有利于载体的导入。,4.筛选重组细胞 (1)筛选 根据标记基因进行筛选插入灭活法。 将目的基因插入特定的某种抗生素抗性基因中，该抗性基因结构被破坏，该种抗生素抗性消失，含有重组质粒的细菌不能在含有该抗生素的培养基上生长繁殖。,根据目的基因及其产物进行筛选：,(2)克隆 5.实现功能表达,(2011高考海南卷)回答有关基因工程的问题： (1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制性核酸内切酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_(相同、不同)黏性末端的限制性核酸内切酶。,(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。 在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处
