鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012课件

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1、鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定,药学院 2010-12-19,实验目的： 1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理 2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作 3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作,1 溶菌酶的性质 溶菌酶 (Lysozyme, EC 3.2.1.17) 由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。 广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。 人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.

2、3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。,鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。 白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。 其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，有四对二硫键，分子量为14300。 碱性球蛋白，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高。其等电点为 pH10.7；其最适 pH 值为 pH7 左右，最适温度为50。,不规则的椭圆体，比较容易结晶，结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。用X射线衍射测得此酶的体积为453030。,性质非常稳定

3、：当 pH 值在1.2-11.3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。 遇热也很稳定，pH 值 4-7、100处理1分钟仍保持原酶活性；pH值 5.5、50加热 4 小时后，酶活不受影响。但是，在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较差，易变性。 热变性随着有机溶剂的增加而直线下降。 溶菌酶对变性剂相对不敏感。在 6M 盐酸胍溶液中，酶完全变性，但在8M尿素中则不变性。 吡啶、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，氧化剂能使酶钝化。,2 溶菌酶的应用 水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间-1，4糖苷，破坏革兰氏阳性细菌细胞壁而具有溶菌作用，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶（Muram

4、idase）。 医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有较好应用价值。,2.1 食品工业上的应用 选择性的分解微生物的细胞壁，而不能作用于其它物质，主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜。 加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中, 也可起到防蛀牙、爽口的作用。 为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶，制成母乳化奶粉，可以加强婴幼儿的抗感染能力，可以促进婴儿胃内乳酪蛋白形成细微凝乳，有利于婴儿的消化吸收。特别对早产婴儿，有防止体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。,2.2 酶工程上

5、的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。,2.3 发酵工业上的应用 溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。 溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。,2.4 医学上的应用 溶菌酶制备的口腔药片或漱口液 治疗副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳炎等疾病。 作口服剂可抑制流行性感冒和腺病毒的生长、抗感染及抗炎症，还具有多种药理作用。 还具有一定的保健作用；有促进血液凝固和止血作用；有组织再生和瘢痕形成促进作用等。,2.5 科学研究中的应用 利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生物细

6、胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领域。,3 溶菌酶的生产现状及前景 上世纪50年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。采用从鸡蛋清中直接结晶得溶菌酶，产品用来制作口服药剂。 上世纪60年代，又开发了离子交换法，进一步降低了生产成本，提高了产品质量，达到了注射级药品质量要求。 上世纪70年代，开发了亲和色谱技术，主要用于高纯度生化试剂的生产。 近来超滤法与其它方法相结合，进一步提高了溶菌酶的生产工艺水平。,目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了其市场需求，

7、每年以10%的速率增长，现在市场规模约为700吨。,我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取率低，处理量小和产品比活低等缺点。,我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发达国家的鲜蛋加工业可以加工鲜蛋总产量的 40%。 1kg鸡蛋大约8元，提取出溶菌

8、酶，可以得到3.5g，溶菌酶纯品售价60 元/1g左右。因此，进行溶菌酶的提取工艺研究，有着重大的科学意义和现实意义。,4 溶菌酶的提取工艺 蛋清的组成成分 蛋清又称蛋白，是一种胶体物质，约占蛋重的 45%60%，颜色为微黄色。 鸡蛋清实际分为四层，由外向内的结构是： 第一层为外稀薄层，贴附在蛋清膜上，占整个蛋清的 23.3%； 第二层为外浓厚层（亦称中层浓厚蛋白层），约 57.2%； 第三层为内稀薄层，约占 16.8%； 第四层为系带膜状层（亦称内浓厚层），为一薄层，加上与之连为一体的两端系带，约占 2.7%。,水分 蛋白质 碳水化合物 维生素和色素 灰分 脂质 酶,4.1 直接结晶法,优点

9、： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。,4.2 亲和色谱法,优点： 分离提纯的倍数较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶，或探索与底

10、物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它在工业上的大规模利用。,4.3 离子交换法,离子交换法具有简便、高效、成本低且可自动化连续操作的优点，目前大部分溶菌酶生产厂家都采用离子交换法。这种方法在实际应用中收率较高，降低了生产成本。 要注意选择合适的离子交换介质。早期有 Amberlite IRC-50 树脂 ，724 树脂。目前采用Doulite C-464、磷酸纤维素（PC）、羧甲基纤维素（CMC）和羧甲基琼脂糖（CMS）等离子交换剂，对溶菌酶都有较强的吸附能力。,4.4 超滤法 超滤法的早期应用主要是对溶

11、菌酶的浓缩精制。它利用膜两侧的压力差，使水分、盐类及糖类等小分子透过膜，而溶菌酶等蛋白质大分子物质留在膜内不能透过，从而达到浓缩效果。它的优点是无相变、操作简单、操作费用低、产品不易失活。 溶菌酶的分子量仅 14300，而蛋清中其它蛋白质的分子量则在 30000 以上，因此可选择适当的分离膜，以超滤法滤出溶菌酶。而残留的大量蛋清则可直接应用于食品加工。,4.5 反胶团萃取法 反胶团的主要应用是萃取蛋白质。目前研究使用最多的是阴离子表面活性剂 AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，简称 AOT)。该表面活性剂价廉易得，分子极性头小，有双链，形成反胶团时不必加入助表面活性剂，形成的反胶

12、团极性核大，有利于蛋白质分子的进入。 AOT/异辛烷/水体系是最常用的反胶团萃取体系，对于分离溶菌酶这类相对较小的分子来说，具有较好的分离效果。但是对于分子量大于 30000的蛋白质则不易分离。 1998 年，反胶团萃取法从蛋清中直接分离溶菌酶。在离心管中将蛋清稀释液与等体积的有机相（AOT/异辛烷）混合，恒温水浴，高速摇动，混合50 分钟后，在 3000rpm 下离心 5 分钟。分离得上层即反胶团萃取液，加入等体积的 pH11.8 磷酸盐缓冲液，震荡 45 分钟，进行反萃取。离心后，收集下层水溶液，分析溶菌酶浓度，测定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收率达 90%，活性达73000u/mg，比

13、大多数商业产品活性高。,5 溶菌酶活力的测定方法 典型作用底物是细胞壁粘多糖、甲壳素及糖苷。,溶菌酶的测定方法有两大类： （1）利用酶反应测定酶活性： 用对溶菌酶敏感的革兰氏阴性菌（主要是溶壁微球菌）、甲壳素及其衍生物、人工合成的寡聚糖作为底物。本类方法简便、灵敏，但影响溶菌酶活性的因素很多，稳定性差。 比浊法 琼脂平板法 比色法 荧光强度及荧光偏振法,（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活性及失去活性的溶菌酶总量。 免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高，为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应用。,盐析法 18

14、78年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重要方法之一。 许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析“（Salting out）。,Hammarster用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。 硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。,硫酸铵优点: 化学性质稳定； 溶解度大，25时能达到4.1mol/L的浓度； 溶解度的温度系数变化较小，在030范围内溶解度变化不大，如25时饱和溶解度为4.1

15、2mol/L，即767g/L，0时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L; 价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。,实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。,饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量： V0蛋白质溶液的原始体积； C2所要达到硫酸铵饱和度； C1原来溶液的硫酸铵饱和度； V应加入饱和硫酸

16、铵溶液的体积。,固体硫酸铵法 所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。 现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法: 常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。 SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate） 破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子