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1、第二十章 比色法和分光光度法,20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法,20.1 概述,20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点： 灵敏度高。10-3 10-6 mol/L。 准确度高。相对误差25。 仪器设备简单、操作简便。 应用范围广。,20.1.2 吸收光
2、谱 光谱区的划分,微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线,波长,1000um,10um,100nm,10nm,红 620 750nm 橙 590 620nm 黄 570 590nm 绿 550 570nm 青 495 550nm 蓝 450 495nm 紫 380 450nm,190400nm,2. 可见光吸收光谱,光的互补色示意图,白光,红,橙,黄,绿,青,青蓝,蓝,紫,单色光：单一波长光 复合光：复合波长光 互补光：处于同一直线上的两种光。 互补光按一定强度比例混合，即得白光。 溶液颜色：互补光的颜色。,吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后，被吸
3、收的光的比例。,吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。,最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱曲线上的最大峰值。,3. 吸收光谱曲线,透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。,四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图 1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯,物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动； 分子自身的转动。 分子的能量 价电子能级的能量振动能级的能量转动能级的能量 能级差与对应的光谱 价电子能级间能量差1-20eV，
4、紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。,4. 物质吸收光的本质,吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发态能级，因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以光子的形式释放能量，从而产生发射光谱。,紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，从基态跃迁到激发态。,20.2 光吸收定律,朗伯（Lambert）定律：一束单色光通过吸光物质的溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度成正比。,A为吸光度; I0为入射光强 I为
5、透过光强; T为透光度 k为比例常数 b为液层厚度（光程长度）,b,I0,I,即：,比耳（Beer）定律： 一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即：,朗伯-比耳定律：,当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸光系数，其单位为cm-1mol-1L。 的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。,朗伯-比耳定律的适用范围： 不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光物质和固态吸光物质； 它是各种吸光光度法定量分析的依据。,思考：摩尔吸光系数如何测定？,工作曲线（标准曲线）： 测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一曲线为直线，
6、即测定信号与被测物浓度成正比。 理想情况下工作曲线过原点； 直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要求两个数量级以上的线性范围； 样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。,偏离比耳定律： 即工作曲线在高浓度端发生偏离。,偏离比耳定律的原因： 比尔定律本身的局限性。比尔定律假设了吸光分子之间无相互作用，事实上，高浓度时分子间相互作用不可忽略。 入射光为非单色光时的偏离。仪器的分光元件（单色器）很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带，而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。 化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、悬浮液）而产生折射、散射和反射，使透过光强减弱（A增
7、大）。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。,20.3 比色法和分光光度法及其仪器,1. 光度分析方法 目视比色法： 光电比色法：用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的吸光度。 光电比色计用滤光片得到较窄波长范围的入射光； 分（吸）光光度法：用分光光度计测定未知溶液和标准溶液的吸光度。 分光光度计用棱镜或光栅做分光元件得到单色入射光。,2. 分光光度计的基本部件,光源,单色器,吸收池,检测系统,结果显示,光源： 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围320-2500nm； 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 使用稳压器保证光强稳定。,单色器： 色散元件：将连续光谱分解为单色
8、光的元件（如棱镜、光栅）； 单色器：由入射狭缝、准直透镜、色散元件、聚焦透镜和出射狭缝构成。 玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ）则可用于整个紫外-可见光区。 光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围宽、色散均匀、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而产生相互干扰。,吸收池（比色池、比色皿）： 用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 杯差：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差。,检测系统： 光电转换元件（硒光电池、光电二极管）。,结果显示部分：
9、直接显示出测定结果的数值（吸光度、透过率等）。,20.4 显色反应与显色条件的选择,显色反应：将无色或吸光系数很小的被测物与显色剂反应，使之转变成具有较强UV或Vis吸收的化合物后测定。,显色剂：能与被测物反应，并使之显（颜）色的试剂。 无机显色剂（硫氰酸盐、鉬酸铵、双氧水等）与被测物生成的有色物的稳定性、灵敏度和选择性都不高，应用较少。 有机显色剂（磺基水杨酸、二苯硫腙等）大多能与金属离子形成稳定的有色配（螯）合物。,生色基团举例： 碳碳三键：max=175nm， 跃迁； 碳碳双键：max=190nm， 跃迁； 苯： max=254，250，204nm， 跃迁； 羧基：max=204nm，
10、n跃迁；,生色基团： 分子吸收紫外-可见光与其分子结构有关； 紫外-可见吸收光谱涉及的电子跃迁是： n（非键轨道）， n和。,对显色反应的要求： 具有较高的灵敏度。摩尔吸光系数103105； 有较好的选择性； 生成的显色物（多为螯合物）稳定、组成恒定； 产物颜色应与被测物颜色有较大差异； 显色条件应易于控制。,萃取光度法： 当显色剂与被测物（通常是金属离子）生成的有色物在有机溶剂中有很好的溶解度时，可以让水相中生成的有色物萃取到有机相，用有机相进行光度分析。,显色条件的选择： 显色剂的用量。 酸度。酸度可能会影响显色剂浓度、显色剂颜色、配合物组成和被测离子存在状态。 显色温度。 显色时间。 溶
11、剂种类。很多显色配合物只在有机溶剂中稳定。 干扰的避免与消除。,20.5 分光光度法仪器测量误差及消除,测定波长的选择： 一般情况下选择显色配合物的最大吸收波长； 为避免干扰，有时也选择干扰小的非最大吸收波长。,比色池的选择： 通常使用1cm比色池； 根据样品浓度和显色配合物的灵敏度高低，可以选用其他厚度的比色池。,目的是消除池壁、溶剂、反应试剂等对入射光的反射和吸收所带来的系统误差； 只有被测产物有吸收，其他反应试剂均无吸收时，可用纯溶剂做参比； 显色剂或其他试剂有颜色时，用试剂空白做参比； 如果干扰物质也生成类似显色产物，也可按下法制备一个参比溶液：在显色之前先将被测物掩蔽起来，只让干扰物
12、质显色，该空白溶液做参比便可消除干扰。,参比溶液的选择：,20.6 分光光度法的应用,1. 应用范围 既直接用于有色物测定，也通过显色用于无色物分析； 既用于常量分析（1%），也用于微量分析（0.01-1%）; 既用于无机离子分析，也用于有机物分析； 既用于定量分析，也可用于定性分析（特征吸收光谱、功能基团特征吸收峰）； 可用于其他领域的研究（如化学平衡）； 目前环境等领域的很多标准分析方法仍然采用光度法。,2. 单组分测定 通常在最大吸收波长下测定吸光度，采用标准曲线法定量。 3. 多组分的测定 吸收光谱不重叠时，可在各自的最大吸收波长下分别测定。 吸收光谱单向重叠，即组分1干扰组分2，而组
13、分2不干扰组分1的测定，这时只能直接测定组分1含量，要测定组分2含量，必须先用组分1的标准溶液测定出组分1在组分2的测定波长下的摩尔吸光系数，并用已测定出的组分1的浓度，计算波长2下组分1的吸光度，并从波长2下组分1和2的总吸光度中扣除组分1的吸光度。 吸光度双向重叠。需解联立方程。,3. 差示分光光度法 分光光度法测定时，吸光度读数通常要求在0.2-0.8范围内，误差最小是A=0.434。 当测定浓度比较大的样品时，由于吸光度读数超出准确读数的范围，会产生很大影响。 差示分光光度法：用比样品浓度略低的标准溶液作参比代替一般情况下的试剂空白参比，使测定吸光度数值在0.2-0.8范围内。,4.
14、配合物组成的测定 摩尔比法：固定金属离子浓度M，改变配体浓度L，在小于配合物组成比时，随着L/M比值的最大，形成的配合物浓度最大，溶液的吸光度增加，达到配合物组成比之后，再增加L，即增加L/M 比值，形成的配合物浓度 已基本变，从吸光度A与 L/M的关系曲线即可求 得配合物的摩尔组成比。,A,L/M,1,2,1,20.7 荧光分光光度法,光致发光现象：某些物质分子受到电磁辐射照射时，能发射出相同波长和更长波长的光。荧光是光致发光的一种。 荧光现象：物质吸收波长较短的光后，发出波长较长的光。 可见（分子）荧光：物质吸收波长较短的紫外光后，发出波长较长的可见荧光。 荧光分析法（荧光分光光度法）：利
15、用分子荧光现象，测定荧光强度，从而测定荧光物质或非荧光物质（衍生化）。,荧光分析法原理,分子吸收光而被激发，使电子从基态上升至激发态，处于某一振动状态； 分子碰撞而失去振动能量，急剧降低至激发态中的最低振动能级； 电子从激发态中的最低振动能级；跃迁回基态的各振动能级，并以光的形式释放能量，此光即为荧光。,基态,激发态,无辐射跃迁,荧光发射光谱,荧光光谱能级跃迁图,能级,吸收,振动能级,荧光分析法的特点： 灵敏度高。比UV-Vis高约3个数量级。 选择性好。首先能发生荧光的物质少，且发生荧光的物质还必须吸收一定频率的光（激发），即使不同物质都吸收了特定频率的光，不同物质发出的荧光波长也不一定相同
16、。 方法简便、快速。 应用范围窄。这是因为能产生荧光的物质很有限。,实例1：荧光分析法测定邻- 与间-羟基苯甲酸,邻- 与间-羟基苯甲酸均含有能发射荧光的苯环，但取代基的位置不同使它们具有不同的荧光性质； 碱性溶液中（pH12），二者在310nm附近紫外光的激发下均发生荧光，而在中性偏酸性溶液中（pH5.5）只有邻-羟基苯甲酸发荧光；对-羟基苯甲酸在上述两种条件下均不发生荧光，故不干扰测定。 对于一个可能含有邻- 、间-和对-羟基苯甲酸的样品溶液，先在pH5.5测定邻-羟基苯甲酸含量，然后在pH12测定邻- 与间-羟基苯甲酸总量，计算得到间-羟基苯甲酸含量。,实例2：环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中痕量亚硝酸盐。,在酸性溶液中，NO2-能与过量4-羟基香豆素形成低荧光衍生物3-亚硝基- 4-羟基香豆素，该产物经Na2S2O3还原为3-氨基- 4-羟基香豆素，此还原产物在
