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1、 1888年 Roux/Yersin 白喉外毒素 1890年 Behring/Kitasato 抗毒素；血清疗法 1939年 Tiselius/Kabat g-globulin 1959年 Porter Fab 、Fc 1962年 Edelman H、L 1962年 Porter Fab(H+L)、Fc(H) 1975年 Kohler/MilsteinMcAb 1980年 TonegawaAb diversity 1984年 Sharon Engineering antibody 1989年 Winter/LernerAntibody Libraries Emil von Behring, 1
2、901, antitoxins Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody Paul Ehrlich , 1908, production of antibody Nobel Prize winners 7 Nature Medicine 2012Nature Medicine 2012年报道，根据年报道，根
3、据 Thomson Reuters PharmaThomson Reuters Pharma的预测，的预测，20122012年销售年销售 前十位的药物中抗体占前十位的药物中抗体占7 7个。个。 抗体开创未来抗体开创未来 抗体的发展 抗血清的制备：19世纪末，Behring 单克隆抗体：1975，Koehler和Milstein Nature 1975 Aug 7;256(5517):495-7 Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. 基因工程抗体：1984，Sharon N
4、ature 1984 May 24-30;309(5966):364-7 Expression of a VHC kappa chimaeric protein in mouse myeloma cells. 抗血清（多克隆抗体）的制备 Foreign proteinsVirusesBacteriaParasitesFungi Antigens B cell B cell activated Humoral response Plasma cells secrete antibodies + TH cell Antigen + Vertebrate body 多克隆抗血清多克隆抗血清 对健康人
5、用疫苗进行主动免对健康人用疫苗进行主动免 疫，免疫前（疫，免疫前（a a）和免疫后）和免疫后1010 天天 （b b）分别采血并对血清）分别采血并对血清 蛋白进行凝胶电泳分析。免蛋白进行凝胶电泳分析。免 疫前血清中的疫前血清中的 球蛋白条带较球蛋白条带较 宽，免疫之后则相对集中。宽，免疫之后则相对集中。 Bruton Bruton 氏氏病患者血清蛋白中病患者血清蛋白中 的的 球蛋白条带缺失（球蛋白条带缺失（c c）。）。 a a1 a a2b b 白蛋白白蛋白球蛋白球蛋白 （c） （a） （b） 小鼠体系：小鼠体系：半衰期短、半衰期短、HAMAHAMA 大鼠体系：大鼠体系：单抗腹水比小鼠高单抗
6、腹水比小鼠高1010倍，易亲合层析倍，易亲合层析 人人 体体 系系：人鼠杂交瘤、人人杂交瘤人鼠杂交瘤、人人杂交瘤 单克隆抗体的制备 蛇毒单抗的制备蛇毒单抗的制备 鼠源单克隆抗体的应用鼠源单克隆抗体的应用 基础研究基础研究 细胞抗原研究及鉴定分类细胞抗原研究及鉴定分类 细胞受体研究细胞受体研究 分子克隆及功能研究分子克隆及功能研究 医学研究及诊断医学研究及诊断 感染性疾病诊断感染性疾病诊断 肿瘤诊断及预后判断肿瘤诊断及预后判断 其它诊断及研究其它诊断及研究 不足：半衰期短、人抗鼠抗体反应（半衰期短、人抗鼠抗体反应（HAMA） 将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因将制备单抗的细胞工程技术与
7、生产重组分子的基因 工程技术和蛋白质工程技术结合起来，对编码抗体的基工程技术和蛋白质工程技术结合起来，对编码抗体的基 因按不同需要进行加工改造和重新组装，转染适当的受因按不同需要进行加工改造和重新组装，转染适当的受 体细胞后表达出抗体分子，这种经基因重组的抗体称为体细胞后表达出抗体分子，这种经基因重组的抗体称为 基因工程抗体基因工程抗体。 基因工程抗体 概概 念念 1. 1. 从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNAmRNA 逆转录成逆转录成 cDNAcDNA 2. PCR2. PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因分别扩增出抗体的重链及轻链基
8、因 3. 3. 构建表达载体构建表达载体 4. 4. 在适当的宿主细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子在适当的宿主细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子 5. 5. 筛选出高表达细胞株筛选出高表达细胞株 6. 6. 亲和层折等手段纯化抗体片段亲和层折等手段纯化抗体片段 基因工程抗体 基本原理基本原理 基因工程抗体 人源化人源化(Humanization)(Humanization)抗体抗体 Humanization （Chimeric/Reshaped Antibody) Constant Constant region(Fc)region(Fc) Mouse antibodyMouse antib
9、ody Antigen-Antigen- binding binding region(Fab)region(Fab) Antigen-binding Antigen-binding regions from regions from mousemouse Specifiv antigen-Specifiv antigen- binding sites from binding sites from mousemouse Chimeric Chimeric antibody antibody (66%)(66%) Fully huamn Fully huamn antibody antibod
10、y (100%)(100%) Humanized Humanized antibodyantibody (90%)(90%) FR：为：为CDR的构象提供环境；参与抗体结合位点正确构象的形成的构象提供环境；参与抗体结合位点正确构象的形成 ； 简单的简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的亲和力移植会丧失或降低原亲本抗体的亲和力 方法：模板替换方法：模板替换较大同源性人较大同源性人FR替换鼠替换鼠FR 表面重塑表面重塑 对鼠对鼠CDR及及FR表面残基镶饰或重饰类似人表面残基镶饰或重饰类似人 补偿变换补偿变换 CDR移植后更换部分的人移植后更换部分的人FR鼠鼠 定位保留定位保留 以人以人FR保守序
11、列为模板进行人源化保守序列为模板进行人源化 人源化抗体的构建策略人源化抗体的构建策略 从同源抗体或抗体的共同序列中选择人源从同源抗体或抗体的共同序列中选择人源FR 确定在确定在FR中起关键作用的氨基酸中起关键作用的氨基酸 以鼠单抗可变区的立体模型作指导以鼠单抗可变区的立体模型作指导 人源化抗体的构建策略人源化抗体的构建策略 关关 键键 目目 标标 保持抗体的亲和力保持抗体的亲和力 降低免疫原性降低免疫原性 从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出 重排的功能性重排的功能性V区基因，并与人抗体区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式区基因按一
12、定的方式 重组，克隆到表达载体中构建鼠人嵌合的轻重链基因表达重组，克隆到表达载体中构建鼠人嵌合的轻重链基因表达 载体，再转入宿主细胞表达，经筛选后制备成特异性的嵌合载体，再转入宿主细胞表达，经筛选后制备成特异性的嵌合 抗体。抗体。 人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体 概概 念念 PCR 鼠抗体基因鼠抗体基因人抗体基因人抗体基因 VL CL VH CH1CH2 CH3VL CLVH CH1CH2 CH3 嵌合轻链嵌合轻链 嵌合重链嵌合重链 IgG 人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体 特特 点点 完全保留鼠单抗的特异性和亲和力完全保留鼠单抗的特异性和亲和力 降低了降低了HAMA不良反应不良反应 一定的免疫原性，一定的
13、免疫原性，V区完全鼠源性区完全鼠源性 改型抗体改型抗体 抗体分子轻、重链可变区的6个 CDR形成CDR平面直接接触抗原， 决定了抗体的特异性，骨架区只 是作为支持CDR襻的支架，而且其 立体构象极为保守。因此，将鼠 单抗的CDR移植到人单抗的骨架区 上，有可能使人单抗获得鼠单抗 的特异性，并最大限度地减少鼠 单抗的异源性，仅有9%的序列来 源于亲本鼠单抗，这种CDR移植的 人单抗称为改型抗体。改型抗体。 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体（改型抗体） 鼠单克隆V区人源化（CDR移植） 治疗性抗体的开发几经反复终于形成蓬勃发展- 鼠单抗人源化的技术功不可没。 鼠单抗人源化时
14、基本选择IgG同种型，在体内IgG 与存在于内皮细胞表面的受体FcRn相互作用，在细 胞内受到保护不被降解而具有较长的半衰期。 同时鼠IgG通过激活补体和结合Fc受体激发一系 列生物效应功能的效率较低，无论是嵌合抗体还是 改型抗体均通过使用人恒定区克服了这一缺陷。 人源化抗体的评价人源化抗体的评价 对于人源化的最主要的初衷，消除异源性的 评价却要复杂的多。 除了降低抗体分子的鼠源序列外，其免疫原性 还受到其它因素如给予抗体的途径和剂量、病 人的病情和免疫状况、抗体所针对的抗原的特 性和部位以及抗体本身激活生物学效应的特性 等均相关，因此应该综合考虑。 人源化抗体的评价人源化抗体的评价 不同种属
15、之间抗体分子可变区的差别远低于恒定 区的差别； 构建改型抗体要比构建嵌合抗体的工作量大的多 ，还常常导致亲和力不同程度的降低，付出亲和力 和增加研制成本的代价是否值得的问题。 人源化抗体的评价人源化抗体的评价 改型抗体相对于嵌合抗体的优越性存在质疑：改型抗体相对于嵌合抗体的优越性存在质疑： 应当制备配对的改型和嵌合抗体，用于足够量的可 比较的人群，观察其诱发抗抗体的生成情况，这是 难以做到的。 迄今大量临床应用的情况揭示其他影响免疫原性的 因素值得重视，因此一味追求序列的同源性而摒弃 嵌合抗体是值得商榷的。 事实上即使完全人源化的抗体也可以诱发抗独特型 抗体，并不可能完全消除治疗性抗体的免疫原
16、性， 而这种抗独特型反应的后果如何待进一步观察。 人源化抗体的评价人源化抗体的评价 欲确切评判人源化对免疫原性的影响：欲确切评判人源化对免疫原性的影响： V V区片断，区片断，1/31/31/801/80，具有与抗原结合的功能，具有与抗原结合的功能 种类：种类：FabFab抗体抗体 单链抗体（单链抗体（ScFvScFv） FvFv片断抗体片断抗体 单域抗体单域抗体SDAbSDAb 最小识别单位最小识别单位MRUMRU 小分子抗体小分子抗体 组成：由重链组成：由重链V V区及区及CH1CH1功能区与轻链二硫键连接，功能区与轻链二硫键连接， 50KD50KD， 为完整为完整IgGIgG的的1/31/3。 应用前景：应用前
