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1、.,等 电 聚 焦 电 泳,Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE,.,一、IEFE 定义,IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。,.,各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。,.,二、IEFE的特点,（一）优点 1.分辨率高
2、（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。 2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。,.,（二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。,.,分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。,.,三、IEFE的基本原理,.,蛋白质分子在不同pH下的解离状态,NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pHpI pHpI pH pI,.,在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加
3、的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。,.,蛋白质分子的电聚焦过程,+ pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c 蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端 蛋白质样品中各组分聚焦成区带,+,.,在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。,.,进行IEFE必须具备3个条件：,有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带,
4、.,（一）pH梯度的建立,用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度,.,1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：,分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； 化学性质稳定； 各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； 在pI处具有足够的电导，导电性均匀； 两性电解质载体的数目要足够多； 可溶性好； 对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。,.,2.载体两性电解质的合成,本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。 pH范围：pH310,丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine
5、（LKB）,加成反应,.,.,.,3.pH梯度的形成,载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。,.,pH梯度形成的过程,.,没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。,.,引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。,.,.,电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以
6、增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。,.,.,.,电解槽中，通电后，正负两极都会发生电 极反应： 正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e- 负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH- 在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a）,.,pH,+,-,a,.,由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH，当环境中的pHpH时，它带负电荷，朝正极移动。(图b),.,pH,+,-,b,pH=pH,A-,.,当环境p
7、IpH时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等点电处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。（图c）,.,pH,+,-,c,pH=pH,A+,.,同样载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。（图d）,.,pH,+,-,d,.,假设在一个系统中含有极多的有适当的等电点和它的等电点处有一定的缓冲能力的两性电解质，因此形成的pH梯度将是连续平滑的。,.,pH梯度的选择 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。,.,
8、.,.,（二）支持介质的选择,作用：防止扩散 抗对流 1.液体介质：蔗糖、Ficoll 2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG,.,（三）聚焦后的检测方法,.,1.各种染色法,考马斯亮蓝染色 银染色 同工酶染色 专一蛋白染色 荧光标记以及免疫方法,.,2.扫描与定量,激光光源强度大、单色性好，所以对IEFE谱带的扫描最合适。 注意：操作程序和条件必须严格相同,.,3.其它检测方法,电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析,.,蛋白质样品及分离容量 1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会
9、沉淀，应 预先除去。 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。,.,等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响： 1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。,.,四、等点聚焦电泳的应用,1.分析分离制备蛋白质、多肽 区分人血清蛋白 测出异常免疫球蛋白 基因分型
10、csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEFE作为第一相,.,.,参考书目,蛋白质电泳实验技术 科学出版社 郭尧君 蛋白质技术手册 科学出版社 汪家政 范敏 主编 电泳 科学出版社 何忠效 张树政 主编,.,实验 血红蛋白的等点聚焦电泳,.,原理,Hb具有四条多肽链和球蛋白（、） pIHbA 22 95% 6.87HbA2 22 2-3% 7.38HbF 22 2% 6.98HbA3 6.87,.,HbA 正常成人血中主要的Hb成分。 HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2
11、.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。,.,HbF 1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的浓度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数正常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成人的正常浓度，以后HbF一直存在。,.,器材,电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头,.,试剂,分离胶缓冲液 Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）,.,操作,1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果,.,思考题,1.PAGE与IEFE有何区别？ 2.本实验的关键步骤是什么？,
