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1、第五章离 心 技 术,离心技术：是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。,第一节 离心技术的基本原理,分离、纯化样品; 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。,悬浮颗粒在液体介质的扩散运动,一、离心的一般原理,颗粒越小，则沉降越慢，扩散现象越严重。,1、离心力和相对离心力 离心力(centrifugal force，F) 指悬浮颗粒在离心过程中所受的离开旋转中心轴的作用力，由下式计算：,相对离心力( relative centrifugal force，RCF) ：在离心场中颗粒所受的离心力相当于它受到的地球重力的倍数（g ）。,
2、F = m w2 r,2 、沉降系数(sedimentation coefficient, S),沉降系数是指在单位离心力作用下，待分离颗粒的沉降速度 。,S的单位为秒，为了纪念离心技术早期的奠基人Svedberg，而把10-13秒称为一个Svedberg单位(S)，即 l S = 10-13秒。在生物学各种论文中常见的某物质沉降系数为多少个S，即指此单位。,S 的数值受颗粒的相对分子质量和形状等特性的影响。,预计沉降时间； 测定物质相对分子质量。,3、沉降速度（sedimentation velocity, v）,沉降速度是指在离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离。,4 、沉降时间（t）和
3、相对分子质量（Mr）,沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。,用于差速离心实验,离心机的分类,按转速分为低速、高速和超速三种； 按用途分为实验型和工业型两种，前者分为分析型和制备型两种； 按使用温度分为常温和冷冻两种； 按驱动方式分为手摇式、油涡轮式、气动式、电动式和磁悬式等。,第二节 离心设备,preparative ultracentrifuge,转头 驱动装置 速度控制系统 冷却装置 真空装置 光学检测系统,离心机的构造,a 水平转头 b 角式转头 c 垂直转头,角度在14-40 之间,离 心 转 头,实验中常用的是普通离心机（转速一般不高于4000rpm），用于分离血清和沉淀细胞、大
4、的沉淀物等。,离 心 管,选用离心管时应考虑的因素： 容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满 形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度梯度离心时圆底离心管更有用 最大离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g） 耐腐蚀性：详细信息可参考厂家的说明书 灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使用。 透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透明 能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管适合 管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管,使用前在无负荷的情况下，开动离心机以
5、便检查其转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。 检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管放入离心套管内，位置要对称。 盖上离心机盖子，接通电源，缓慢加速到所需速度。 离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。 离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即切断电源，待检查排除故障后方能使用。,离心机的使用及注意事项,制备离心技术：是以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。,第三节 常用离心方法及应用,制备离心技术,一般制备离心技术 制备超速离心技术,差速沉降离心,密度梯度区带离心,差速区带离心 等密度区带离心,概念：简称区带离心法，
6、是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。,密度梯度离心法,差速区带离心 等密度区带离心,不同颗粒存在着一定的沉降速度差,20%S或分子量相差3倍,不同颗粒存在着一定浮力密度差,密度梯度离心原理,不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油； 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。,密度梯度离心法应用,利用密度梯度离心的原理，用ficoll液
7、或precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞（PBMC）。 目前比较常用ficoll密度梯度法。,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法,一、步骤 1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640 充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心2000rpm20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。,4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入倍以上体积的Hanks液或RPMI1640，1500rpm10分钟，洗涤细胞两次。 5. 末次离心后，弃上清，加入含有10小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。,
