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1、上海斯丹赛生物技术有限公司,SIDANSAI Biotechnology,Innovator on TALEN technology and Stem Cell research,TALEN技术在基因功能研究及ips领域中的应用,靶向基因修饰,What? 通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能。 Why? 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段。 Way? 如何基因敲除（Knockout）,基因敲除的方法,同源重组 (Homologous Recombination) 依赖DNA分子的互补性，经典基因敲除方法 特点：效率低（1 pe
2、r 106 cells），实验周期长 RNA干扰 (RNA interference) 依赖RNA分子的互补性：高效性，特异性； 特点：临时性，基因沉默而非敲除；,锌指核糖核酸酶（ZFN） 20世纪末 DNA 识别域 (ZFP) + 非特异性核酸内切酶构成（FokI),依赖DNA识别域的特异性：效率高 有脱靶现象，专利被垄断,基因敲除的方法,TALE domain: DNA 识别域 TALE，植物病原体黄单胞菌 Xantomonas 用于调控宿主基因 由34的氨基酸长度的重复单位构成 第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同 RVD决定识别位
3、点不同 Nuclease domain: DNA剪切域 FokI，发现于海床黄杆菌 Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域 形成二聚体时发生剪切,N,C,TALE,FokI,LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG,NI A HD C NG T NN G,A T T C T G C T A A C T C A T A C,新的里程碑技术： TALEN (transcription activator-like effector nuclease，2010年底),TALEN切割双链,5,5,3,3,左臂,右臂,FokI
4、聚合,DSB Double strand Break,Non-homologous End Joining (NHEJ),Homologous Recombination (HR),无模板,有模板,Gene Disruption,Gene insertion,Gene replacement,TALEN取代了过去,构建TALEN质粒,如何将这些高度重复的 DNA片段连接起来？,TALEN的组装(Golden Gate),PCR 3步,Digest 2步,Ligate 2步,一步法连接,只要4-5小时，这些片段就全部连接起来了,一步连接,1,2,3,6,5,4,9,13,7,10,12,16,8
5、,14,11,15,17,18,FastTALETM连接TALEN,N,C,N,C,TALEN modules at 9 positions,TALEN backbone vectors,TALEN assembled vectors,Promoter,FokI,Promoter,FokI,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x16,x16,x4,x16,Position 1,Position 2,Position 3,Position 4,Position 5,Position 6,Position 7,Position 8,Position
6、9,1/2,9 x 12 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172,CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6,Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12,多种TALEN骨架载体，满足不同物种需求,第一组载体：干细胞专用打靶载体，采用EF1启动子。 第二组载体：构建动物模型专用载体，含有原核表达启动子sp6或T7，便于体外转录。 第三组载体：普通细胞打靶载体，采用CMV启动子。 第四组载体：植物专用打靶载体，采用ubiqutin或35s启动子。,TALEN质粒构建流程,靶点设计,挑克隆 细菌培养,DNA质粒抽
7、提 酶切鉴定,得到测序 正确质粒,TALEN连接,细菌转化,质粒测序,Day 1,Day 2,Day 3,Day 4,4天得到构建正确的TALEN质粒！ 简单、快速！,靶点设计,Decide TALEN target (left arm/right arm) TALE-NT2.0 https:/tale-nt.cac.cornell.edu/ DNASTAR Target: 12-19bp Spacer: 12-21bp 5 end 0 position: must be T 为了得到高活性质粒，建议设计2X3组合。,Spacer 12-21bp,5,5,3,3,TALEN连接,1.设计序列，
8、 选择模块,2.加样， 进行连接,4-5h完成,转化至感受态细胞 在Kana+ LB平板中培养,细菌转化,挑单克隆， 细菌培养,挑 5-12 个克隆（连接效率50%） Kana+ LB培养液,单克隆菌落,将单菌落接入含5ml Ka+的LB培养液的试管中,DNA质粒抽提，酶切鉴定,DNA质粒小抽提 使用BamHI+PstI双酶切，植物载体采用BamHI+SpeI,target: 15 nt,target: 18 nt,左臂,右臂,1kb Marker,1 kb Marker,Digestion,Digestion,Asssembly length: 15x102=1530,Asssembly l
9、ength: 18x102=1836,On backbone: 531,Total length: 1530+531=2061,On backbone: 531,Total length: 1836+531=2367,1个单模块（由34个氨基酸102个碱基组成）识别一个碱基,上游引物: 5-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3 下游引物: 5-AGCTGGGCCACGATTGAC-3,质粒测序,测序结果比对,标准序列,测序结果,得到测序正确质粒,TALEN 的实际应用,DNA水平的 基因敲除,DNA水平的 定点插入,DNA水平的 单碱基修饰 （点突变）,建立基因敲除/敲入的真核细胞系 建
10、立基因敲除/敲入的真核生物模型,DNA水平的miRNA敲除,应用实例1 细胞模型,Hela细胞中XX基因敲除的稳转系建立： 项目执行时长2个月,设计TALEN识别序列； 构建TALEN载体； 测序验证质粒正确性,实验流程：,序列100%正确,脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天,收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组DNA, 进行PCR,PCR产物送测序,比对测序结果，初步确认TALEN活性,续上,大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）,PCR产物TA克隆、单克隆测序确定打靶效率,续上,2020/8/11,最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立
11、成功,消化细胞呈单细胞，接种于96孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定,部分单细胞克隆测序结果：,单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。,挑选至少50个单克隆测序, ，鉴定出双拷贝敲除的单克隆,续上,Knock-in 载体构建,构建knock-in同源重组载体,WT,Donor,提高同源重组效率 同源臂构建简单，500-1000bp 利用抗性基因快速进行筛选,打靶示意图（基因敲入）,Dirk Hockemeyer, Haoyi Wang, Samira Kiani.Genetic engineering of human ES and i
12、PS cells using TALE nucleases,Nat Biotechnol. ; 29(8): 731734.,打靶示意图（定点突变）,Su Mi Choi, Yonghak Kim,efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells . HEP,12-2140.,打靶示意图（定点缺失）,打靶效率经验参考,建立knock-out细胞系（双拷贝敲除）： 293T，hela细胞：建系成功率100%，目前成功建系19个，打靶效率
13、约为30 % -70%，最短耗时2个月 ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前成功建系7个，打靶效率约为20 % -50%，最短耗时4个月,数据统计至2013.07月,打靶效率经验参考,建立knock-in细胞系（单拷贝敲入） ： 293T、hela细胞等：建系成功率100%，目前已成功建系6个，打靶效率约为20 % -55%，最短耗时3个月 ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前已成功建系2个，最短耗时5.5个月，打靶效率约为10 % -28%,数据统计至2013.07月,成功实例2 动物模型斑马鱼,Zebra fish-gene A,WT,TALEN,580bp,Zebrafish
14、-geneA (Kpn I),WT,TALEN,580bp,401bp,179bp,Genomic PCR,Restrictive enzyme digest,斑马鱼内XX基因敲除,结果回馈,我方设计TALEN识别序列； 提供最终的TALEN质粒,TALEN质粒线性化； 体外转录,显微注射一细胞期受精卵,48h后收集，抽提胚胎 基因组DNA,PCR扩增，酶切看结果,打靶效率为80%以上,应用实例3 动物模型小鼠,1. 设计构建TALEN打靶载 2. 细胞水平TALEN 活性检测 3. 体外转录生成mRNA 4. 往受精卵注射mRNA 5. 得到嵌合体小鼠（F0） 6. 得到F1 heteroz
15、ygote 7. 得到F2 homozygote,1. 设计构建TALEN及KI donor载体 2. 细胞水平TALEN活性检测,基因敲除小鼠,基因敲入小鼠,3. 体外转录生成mRNA 4. 往受精卵注射mRNA/DNA 混合物,3. 建立ES基因敲入细胞系 4. 将ES细胞系注射至囊胚,5. 得到嵌合体小鼠（F0） 6. 得到F1 heterozygote 7. 得到F2 homozygote,应用实例3 动物模型小鼠,PNAS. 2013 Mar; 110(10):3782-7,应用 I: 基因敲除,TALEN 的实际应用,Nat Biotechnol 2013 Jan; 31(1):23-4,Phenotypic analysis of gene-specific knockout mice has transformed our understanding of in vivo gene functions. Generation of knockout mice, however, remains a time-consuming and expensive proce
