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1、.,1,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,.,2,实验目的,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,.,3,实验流程,配胶,样品制备,电泳（1.52h）,染色（20min）,脱色（30min2h）,分析,配分离胶(下胶),配浓缩胶(上胶),.,4,实 验 过 程,1.装配装置,BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶),.,5,2.凝胶配制,实 验 过 程,*Acr有神经毒 性,.,6,实 验 过 程,3.灌胶,凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入, 否则凝结无法注胶.注胶
2、过程最好一次性完成,避免产生气泡.,1cm,下胶高度，距齿下1cm,A,平齐，排气泡 加速聚合,凝固,梳需平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,.,7,加入分离胶溶液 pH 8.8,制备分离胶(下胶),封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,.,8,分离胶 pH 8.8,制备浓缩胶(浓缩胶),.,9,样品处理,.,10,实 验 过 程,4.上样、电泳,A. 样品加热，上样,B. 电泳,+,（1）上胶 恒压80V (8V/cm),（2）下胶 恒压120V (12V/cm),.,11,浓缩胶 pH 6.8,分离胶 pH 8.8,上样及电泳,开
3、始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,.,12,Staking gel,Separating gel,.,13,电 流 路 径,负极,正极,内槽,外槽,凝胶,外槽,.,14,实 验 过 程,5. 染色、脱色,染色20分钟,B. 脱色30分钟至2小时,考马斯亮兰R250,.,15,蛋白质的染色方法,氨基黑 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 考马斯亮兰R-250，G250 G250测定蛋白含量 银染 敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳,.,16,聚 合 原 理,( )n,( )n,( )n,( )n,( )n,+,*Acr有神经毒 性,n决定了交联度 与浓
4、度一起决定孔径的大小,过硫酸铵是催化剂 TEMED是加速剂,蛋白质是29：1 核酸是19：1,.,17,实 验 原 理,1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。,电荷 分子大小 分子形状,.,18,实 验 原 理,浓缩效应,Cl-,Gly-,Cl-,Gly-,Cl-,Gly-,PH6.8,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Gly-,Gly-,主要离子,氯离子,甘氨酸离子(pI5.97),蛋白质离子,Gly-,Gly-,Pr-,Pr-,Pr-,PH8.8,.,19,Pr为什么带负电,加 样 缓 冲 液,二硫键,盐键,疏水作用,氢键,巯基乙醇,断二硫键,SDS
5、,断化学键 带负电荷,甘油,SDS：Pr=1.4:1,促沉,溴酚兰,Tris,?,.,20,实 验 原 理,浓缩效应,Cl-,Cl-,Cl-,pH6.8,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,主要离子,氯离子,甘氨酸离子(pI5.97),蛋白质离子,pH8.8,快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速,.,21,实 验 原 理,浓缩效应,Cl-,Cl-,Cl-,pH6.8,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,主要离子,氯离子,甘氨酸离子 (pI 5.97),蛋白质离子,pH8.8,5%,10%,快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速 浓缩效应,.,22,.,23
6、,实 验 原 理,分子筛效应,pH6.8,主要离子,氯离子,甘氨酸离子(pI5.97),蛋白质离子,pH8.8,5%,10%,甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应,.,24,实 验 原 理,分子筛效应,pH6.8,主要离子,氯离子,甘氨酸离子(pI5.97),蛋白质离子,pH8.8,5%,10%,甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应,.,25,实 验 原 理,分子筛效应,pH6.8,pH8.8,5%,10%,lgMw,电泳迁移率,lgMw=-bx+K,Pr Mw在11.7-165Kd,.,26,实 验 原 理,分子筛效应,pH6.8,pH8.8,
7、5%,10%,迁移率=,蛋白质移动的距离,脱色后的胶长,染色前胶长,指示剂移动的距离,.,27,实 验 原 理,迁移率=,“蛋白质移动的距离”,指示剂移动的距离,染色前,蛋白质的带在哪呢？,L1,L2,L3,L4,Lx,L1 X L3,L2 X L4,.,28,PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.,.,29,注意事项,采用此法测蛋白质分子量时，必须完全打开二硫键。 多亚基蛋白问题 有
8、些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。,.,30,思考题,在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,.,31,97,66,44,29,20,14,Marker,.,32,Tanon-1600数码凝胶图像分析系统 GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00),.,33,诱导前后蛋白表达差异,IPTG诱导表达
9、His-GFP融和蛋白（31.9kD）。 1为诱导前，26分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。,.,34,电泳过程中的不正常现象,1 “微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。,.,35,2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,.,36,3 “拖尾”现象 样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大,解决办法： 加样前离心 选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲
10、液 加增溶试剂 降低凝胶浓度,.,37,4 “纹理”现象 样品中的不溶性颗粒引起的,解决办法： 增加溶解度 离心除去不溶性颗粒,.,38,5 偏斜现象 电极放置不平行或加样位置偏斜引起,.,39,6-2 整块胶分离的条带太宽 主要是未浓缩好的原因 处理办法： 适当增加浓缩胶的长度； 保证浓缩胶贮液的 pH 正确 （6.7） ； 适当降低电压；,6-1 某一条泳道条带太宽 加样量太多或者加样孔泄露引起,.,40,7. “鬼带” “鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，
11、致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性， WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法： 在加热煮沸后， 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇， 以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。,.,41,谢谢!,.,42,附：蛋白质的提取与定量方法,蛋白质提取 不同来源，不同的方法,.,43,提 取 原 则,细胞的破碎 合适的裂解液 一般在冰上进行 加入适当的蛋白酶抑制剂,.,44,哺乳类细胞的裂解液-RIPA,50 mM Tris-HCl (pH 7
12、.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非离子性去垢剂 ）, 0.1% SDS,.,45,蛋白酶抑制剂,.,46,定量方法,紫外吸收法 BCA法 Lowry法 Bradford法,.,47,以双缩脲为基础的方法,1. BCA法 bicinchoninic acid 二奎啉甲酸法,.,48,以双缩脲为基础的方法,2. lowry法 folin酚法 磷钨酸和磷钼酸 钨蓝、钼蓝 BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍 0.005 - 0.10 mg/ml,.,49,Bradford法,考马斯亮蓝G250染色法 此法根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。 与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。 反应化合物在595nm处有最大光吸收值 灵敏度25 g/ml200 g/ml,.,50,注意各方法适用条件范围,.,51,选择蛋白质定量方法时应考虑,实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质； 测定所花费的时间等。,/10/29,.,52,
