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1、第一节 概述 第二节 工程CHO细胞系的构建 第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制 第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,概 述,红细胞生成素,第一节 概 述,概 述,红细胞生成素,1、天然红细胞生成素的生成和作用原理,1890：现象，低氧压下红细胞增多 1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素 （erythropoietin，EPO） 动脉氧分压是EPO生成调节因素,概 述,红细胞生成素,3、红细胞生成素的生理作用,红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生成 刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异性 刺激作用的细胞因子。,EPO与靶
2、细胞结合：骨髓、脾、肝细胞等，促进前体细胞增殖和分化，生成RBC,概 述,红细胞生成素,4、重组人红细胞生成素,第一代：两种，天然基因表达，rhEPO-和rhEPO- 1989：Amgen, Epogen；1990，Biotech，Procrit rhEPO-，CHO细胞生产 Roche，NeoRecormon(rhEPO-)，BHK细胞系,概 述,红细胞生成素,4、重组人红细胞生成素,用基因工程技术生产的人红细胞生成素 第二代：EPO突变体 2001，Amgen，Arasnep长效 rhEPO-突变体，170aa，有5个N糖基化位点 唾液酸残基高2倍，半衰期36h（EPO为4-8h） CHO
3、细胞系生产,概 述,红细胞生成素,适应症：各类贫血 起因：慢性肾衰竭、AIDS、肿瘤、化疗等引起的贫血 开发新的临床适应症：肾病和糖尿病 在生物制品中排位NO.1，2004年全球销售额11.9BUSD， 重磅 炸弹药物 各类体育竞技中，禁止使用的药物？,概 述,红细胞生成素,大小：166aa 糖链占分子量的39% 糖基化程度与准确性对活性影响很大 pI4.24.6，对热和pH变化相对稳定。,概 述,红细胞生成素,天然提取制药工艺： 由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红 细胞生成素。产量极其有限。 （未用生产） 基因工程制药工艺： 重组人红细胞生成素（应用生产中） 化学制药工艺： 基于
4、红细胞生成素的受体，研究与红细胞生成素功能 相当的化学药物（开发中）,概 述,红细胞生成素,重组人红细胞生成素工艺路线的研究,SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中瞬时表达 红细胞生成素 昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改 善，但糖基化程度较小 干扰素-基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞， 产生较高量的rhEPO,概 述,红细胞生成素,重组人红细胞生成素工艺路线的研究,大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。 家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性 较低、活性较差等问题。 在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞 生成素与天然红细
5、胞生成素相似。现在工业生产中多采 用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。,第一节 概述 第二节 工程CHO细胞系的构建 第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制 第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,红细胞生成素,第二节 工程CHO细胞系的构建,细胞系的构建,红细胞生成素,细胞系的构建,人红细胞生成素基因的克隆策略： 从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中 克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA，RT-PCR克隆全长 序列 将目标基因与载体在连接体系中连接过夜，连接酶为 Phage T4连接酶 表达载体的构建： 人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、
6、大肠 杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。,红细胞生成素,细胞系的构建,细胞培养： CHO dhfr- 60%汇合；用无血清培养基洗涤3次 脂质复合物制备：细胞载体prEPO和pDHFR与脂质体混合 共感染：与无血清培养基混合，加到培养皿中，37， 5%CO2，4h 抗性克隆的获得：在相关的培养基中培养后进行抗性筛选,红细胞生成素,细胞系的构建,胰蛋白酶消化，1:5稀释，在含有1 nmol/L MTX培养基上 培养，34d更换培养基，培养1014天，至抗性克隆 出现。 传代培养：1:5稀释，按1 nM5 nM25 nM100 nM 200 nM1000 nM使MTX浓度逐次升高，筛选抗
7、性克隆。 抗性克隆培养于100 mm培养皿中，按1:500稀释，继续 培养35天，集落2-4 mm。 酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素。,第一节 概述 第二节 工程CHO细胞系的构建 第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制 第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,红细胞生成素,转瓶生产：Amgen 公司 反应器生产,rhEPO的大规模生产方式,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,冻存的细胞株37水浴，无菌离心。 加适量DMEM培养基（10%小牛血清）。 37、CO2培养箱培养，连续传三代。 细胞消化
8、后接种，制成接种细胞浓度(2.5106个/ml)。,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液， 高压灭菌1.5h。 接种：排出PBS缓冲液，加DMEM培养基，接种。 贴壁培养：pH7，50r/min，37，DO50-80%。 扩增培养：80100r/min，培养10d。 灌流培养：控制温度、DO、pH值等培养条件，进行 无血清培养基连续培养。 收获培养物，48保存。,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上， 随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。 温度控制：较为严格，恒定37。 pH值控制：7.0-7.2
9、,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。 溶解氧控制：在50-80的范围内，通入氧气、空气或 氮气的比例混合气体。 葡萄糖控制：流加补料。 代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度， 减少对细胞损害。,培养过程与工艺控制,第一节 概述 第二节 工程CHO细胞系的构建 第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制 第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,第四节 分离纯化工艺,红细胞生成素,CMSephrose亲和层析： Na-HAc-异丙醇活化，并用 20 mmol/L Tris-HCl平衡缓冲液平衡。 收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层析柱，平
10、衡缓冲液 平衡。 02 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。 透析：0.1mM Tris，过夜，换液4次。,培养过程与工艺控制,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,透析后
11、的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。 01 mol/L NaCl- Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。 上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱，10%70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。 上凝胶柱（预先用20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。 rhEPO产品：蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活可为2 105 IU/mg 。,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,纯度，蛋白质含量，分子量等 体外活性：ELISA测定（原理免疫沉淀），单 位unit（IU） 体内活性：网织红细胞计数法，注射BALB/c小 鼠，
12、眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。 比活性(U/mg)：单位重量蛋白质(mg) 中所含的活性,培养过程与工艺控制,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,1、 杂交瘤制备原理,B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这 种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限 的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也 是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形 成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是 既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴 细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠 体内即可获得大量的高效价、单一的特异性
13、抗体。这种技术即 称为单克隆抗体技术。,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,2、 杂交瘤制备过程,制备工艺： 免疫动物 亲本细胞制备 细胞融合 培养筛选和鉴定 克隆化,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高， 也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 有遗传标记，如HGPRT-或 KT-。 能在CM中生长良好 利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等， 可以加速和促进肿瘤的生长。,2） 骨髓瘤细胞制备,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,取对数期骨髓瘤细胞和B淋巴细胞悬液，于离心管中以1:10混匀，离心、去上清 在37下，使两者充分接触
14、 滴加PEG后，继续震动2min 添加培养基稀释PEG，终止其作用 离心后，置于培养板中用HAT培养基进行培养,3） 原生质体融合,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,4） 杂交瘤的筛选,HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后， 形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的 杂交瘤细胞才有意义。 在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激 酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂 交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,指将抗体阳性孔进行克隆化。保证HAT筛选后的杂交瘤克隆 一个孔内只有一个克隆。 克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克 隆化。 克隆化的方法，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。,5） 杂交瘤的克隆化,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,
