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1、口腔上皮细胞原血红素a/b/c检测 （苯胺蓝染色液）,口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之 一，包括口腔癌按其发生部位可分为龈 癌、唇癌、颊癌、舌癌、口底癌、腭癌、 上颌窦等。国内文献报道口腔癌的发病 率为1.061.69/10万人口。口腔癌占全身恶性肿瘤的 1.93.5%，占头颈部恶性肿瘤的4.720.3%。相比其他部 位的癌症，口腔癌更易转移、治疗花费大、预后差，目前 健康，甚至生命。因此，口腔癌的预防就显得十分重要。 从早期发现入手，口腔癌是可以预防的。,既往口腔癌的筛查方法主要依赖肿瘤标志物癌胚抗原（）检查，但特异性很差。检查和细胞学检查不适于筛查或早期诊断。研发敏感性高、特异性强、经济便
2、捷的口腔癌筛查方法非常迫切。,苯胺蓝染色液（ 口腔细胞特殊染色 TNO SSF-2 型）是一种分析口腔上皮组织细胞病理变化的检 测试剂，属液体活检病理学检测技术，应用于口腔 癌筛查及协助早期诊断。该产品为无创取材、靶向 、快速、自动化分析和/或床旁（POCT）诊断， 510分钟即可显示检测结果。具有新颖性、创新性、 实用性，高灵敏度、高特异度，准确、快速、经济、 操作方便。独家研制、专利产品，是口腔癌筛查、 普查和协助早期诊断的适宜技术。,【操作方法】 1、全面的检查需要良好的照明，压舌板，手套和纱布垫。口镜或 咽喉镜有助于口腔检查。 依次检查牙、牙龈、口腔黏膜、舌、唾液腺 导管口及软硬腭。应
3、注意其形态、颜色、质地的变化，包括有无肿胀、 增生、萎缩、点彩消失等；上皮覆盖是否完整，有无疱疹、丘疹、糜 烂、溃疡、过度角化、瘢痕、肿块及色素沉着；是否有出血；挤压腮腺 或下颌下腺时导管口处有无涎液流出及涎液的情况。若发现异常，用采样 拭子在局部擦拭，取得口腔黏膜渗液和分泌液。一般取液量为0.51ml， 以棉拭子头部全部湿润为度。 2、取得口腔黏膜渗液和分泌液后，打开样本管（红塞），把拭子头部 置入样本液内充分搅动，使蘸在上面的液体与样本保存液混匀制得样本液。,【注意事项】 1、正确取材是准确检测的前提和保证，全面、认真检 查口腔各个部位，发现细微的异常，以使苯胺蓝染色液体 活检病理学检测技
4、术成功实施。 2、苯胺蓝染色液体活检病理学检测技术是一项靶向检 测技术，取材部位与检测结果具有组织器官的一致性。 3、本检测为筛查方法，检验结果仅为提示性资料，为 评估口腔恶性肿瘤患病风险提供参考，请结合临床进一步 检查作出疾病判断。 4、口腔内出血性疾病容易造成假阳性，应结合病史、 体征及其它检查进行鉴别诊断。,技术原理,肿瘤细胞 Warburg effect,高耗糖（10倍以上） 糖酵解活跃 三羧酸循环抑制,Pasteur effect,Warburg effect,氧化磷酸化与糖酵解相互调节，动态平衡,肿瘤细胞,正常细胞在氧充足的情况下， 利用线粒体的氧化磷酸化产生 为细胞的生命活动提供
5、90%ATP 。在氧不足的情况下，细胞能量 转变为糖酵解（无氧糖酵解和磷酸戊糖途径 ）的方式。有氧状态下氧化磷酸化对糖酵解有抑制作用，称为Pasteur效应。,诺贝尔奖获得者德国生物化学家 奥托.海因里希.瓦博格（Otto Heinnich Warburg ）发现肿瘤细胞 的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅 产生1/10的能量。肿瘤细胞主要通过 磷酸戊糖途径产能，即便在有氧情况下，氧化磷酸 化反应也不能对糖酵解产生抑制作用。这称为瓦博 格氏效应（Warburg effect）。,FDG-PET/CT 的设计原理 肿瘤细胞糖代 谢异常 Warburg effect,恶性肿瘤细胞由于代谢旺盛，导致
6、对葡萄糖的需 求增加，因此静脉注射葡萄糖类似物18FDG后， 大多数肿瘤病灶会表现为对18FDG的高摄取，因此 可应用18FDG PET-CT显像可早 期发现全身肿瘤原发及转移病 灶，准确判断其良、恶性，从 而正确指导临床治疗决策。,PET-CT运营成本相当高，进口价格两千多万人民币，再加上人 员、维护费等费用，成本在3000万元左右。但很多医院一年即收 回成本。 PET-CT全身检查一次,辐射量 相当于一个正常人30年的辐射， 一小时就接受。 相当于在日本 福岛核电站泄漏的第二天站了 一天。 2011年底，卫生部在一份文件中提出要规范使用PET-CT，要求 其检查阳性率不低于70。这一表态意
7、味着PET-CT今后必须对症 使用。,为解决PET-CT运营成本高、对人体有较重的辐射 危害问题，我们根据同一原理，即肿瘤细胞糖代谢 增高（瓦博格氏效应）设计出一种简便易行、安全 无创的恶性肿瘤筛查和早期诊断的方法，称为 Pretty Positron Emission Tomography of Tube。,P-PET 精巧的试管PET 苯胺蓝染色液 Pretty Positron Emission Tomography in Tube,磷酸戊糖途径,肿瘤细胞瓦博格氏效应（Warburg effect）：糖代谢异常 1、耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。 2、磷酸戊糖途径活
8、跃。,恶性肿瘤细胞糖酵解代谢活跃的机制较为复杂，目前尚未完全 明确。主要包括以下几个方面的因素: 1、原癌基因的激活（低氧诱导因子hypoxia-inducedfactor HIF的 激活导致肿瘤细胞糖酵解增加； 丝苏氨酸蛋白激酶PI3KAKT信号 转导通路激活刺激糖酵解）； 2、肿瘤抑制基因的失活（p53调节细胞能量代谢）； 3、低氧微环境； 4、糖酵解调节机制异常。 5、线粒体氧化磷酸化功能的损害等。,肿瘤细胞糖代谢关键蛋白及酶学变化,1、肿瘤细胞摄取葡萄糖能力 是正常细胞的10倍左右，肿瘤 细胞膜表面存在大量葡萄糖转 运体（GLUT）。大量恶性肿瘤 GLUT3，GLUT4过量表达，GLU
9、T1 在正常组织中表达，在恶性肿 瘤组织中表达增高。,2、在肿瘤细胞中，氧化磷酸化的酶合成受到抑制，如细胞色素C，丙酮酸脱氢酶系复合体、琥珀酸脱氢酶，延胡索酸水和酶等；,3、糖酵解酶合成增多，例如己糖激酶（HK），6-磷酸葡萄糖脱氢酶，磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶和磷酸甘油醛脱氢酶等。,磷酸戊糖途径,葡萄糖转运蛋白,己糖激酶,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,丙酮酸脱氢酶系,中国科学技术大学生命科学学院吴缅教授和美国宾夕法 尼亚大学医学院杨小鲁教授的合作研究结果认为，这种肿 瘤细胞代谢异常与抑癌基因p53突变有关。在正常状态下， 阻抑蛋白p53与磷酸戊糖途径上第一步反应的关键酶“葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶”相结
10、合，抑制它的活性，阻止磷酸 戊糖旁路的进行，确保正常状态的细胞中主要通过三羧酸 循环途径进行能量代谢。,阻抑蛋白p53+葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,p53,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,葡萄糖,丙酮酸,乙酰辅酶A,三羧酸循环,ATP 二氧化碳 水,葡萄糖,戊糖磷酸代谢途径,NADPH,果糖-6-磷酸,二氧化碳,Warburg 效应,Pasteur效应,3-磷酸甘油醛,抑制,己糖激酶,己糖激酶,丙酮酸脱氢酶系复合体,HIFPI3K PI3KKT,GLUT,Ferton氏反应,Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- +OH,芬顿（Ferton）氏反应，是H2O2与线粒体内的功能性 二价铁离子反应产生活
11、性氧（ROS，reactive oxygen species）的反应。1mol的H2O2与1mol的Fe2+反应后生成 1mol的Fe3+，同时伴随生成1mol的OH-外加1mol的羟自由基。 在pH 4 的溶液中，羟自由基的氧 化电势高达2. 73 V。 另外，还生成1mol的过氧自 由基。,羟自由基的氧化态势仅次于卤族元素氟。但是，羟自由基半衰期短（不到1s），作用直径很短（3nm）。因而最邻近羟自由基的部位受到攻击的可到性最大。线粒体内膜裸露于内膜上氧化呼吸链产生的大量自由基的环境中，所受氧化损伤最严重。,线粒体内膜氧化损伤 促使细胞原血红素释放,原血红素 在动物体内主要存在铁卟啉（血红
12、素）和铜卟啉（血蓝素），在植物体内主要存在钴卟啉（维生素B12）和镁卟啉（叶绿素），它们都是细胞载氧进行呼吸作用和植物细胞进行光和作用过程中的关键物质。,卟啉类,血红素 （铁卟啉）,三价铁离子,二价铁离子,高铁血红素,亚铁血红素,原卟啉IX,原血红素 （亚铁原卟啉）,原卟啉 15个异构体,原血红素 a/b/c/等,氯化高铁血红素 羟基高铁血红素等,卟吩,血红素家族,二亚硝基亚铁血红素 碳氧亚铁血红素等,胚期原血红素 胎儿期原血红素 成人型原血红素,血红素a 卟啉环的第八位上以甲酰基代替甲基，第二位上以羟代法呢烯基代替乙烯基。,血红素b（甲酰血红素） 卟啉环上的侧链取代基为4 个甲基,蛋白质分子
13、,半胱氨酸,血红素c 卟啉环上的乙烯基与蛋白质分子中的半胱氨酸巯基相加成的硫醚键共价结合,细胞色素A,细胞色素B、细胞色素P450、 血红蛋白和肌红蛋白等,细胞色素C的活性基,血红素a/b/c共同或分别存在于 铁硫蛋白及辅酶Q、ATP合酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、单胺氧化酶、血红素加氧酶 、 NAD（P）H氧化酶、鸟氨酸氧化酶、一氧化氮合成酶、腺苷酸激酶、苹果酸还原酶等120余种酶类中。,线粒体（mitochondria） 在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。 线粒体消耗着人体95%以上的氧，并以ATP的形式生产人体几乎所有的能量，素有“细胞 动力工
14、厂”之称。整个人体里约有1亿亿个。 线粒体是重要细胞器； 原血红素是线粒体功能关键物质； 原血红素a/b/c在线粒体中存在最多,也是原血红素a/b/c最集中的细胞器。,线粒体是原血红素最集中的细胞器。原血红素a/b/c在细胞线粒 体内，以细胞色素和以原血红素为活性基的酶两种形式参与氧化 磷酸化反应电子传递。原血红素与珠蛋白结合在一起发挥作用， 称为血红素蛋白。 使用新型 X 射线激光衍射测定血红素 蛋白结构表明，原血红素就位居线粒体基 膜处血红素蛋白多肽构成的疏水桶（血红 素口袋）内。,原血红素位于血红素蛋白 折叠形成的疏水核（血红 素口袋）内，它主要依靠 Fe2+与F8His的咪唑氮配位 而
15、挂在Pr链上。在链中， 有一个丙酸基与CD3His相连； 在链中，原血红素的两个 丙酸基别CD3Ser和E10Lys相连。,线粒体的的强氧化损伤，使血红 素蛋白中珠蛋白与原血红素之间的 亚基之间作用力减弱，离子键、氢 键、疏水键断裂，使多肽链的折 叠伸展、断裂。血红素口袋被打开， 使那些原来包藏在蛋白疏水核部的原血红素释放谓 之肿瘤细胞原血红素（Protoheme of Tumor Cells TCPH）。,再者，超氧自由基是一种 亲脂性小分子，可以进入疏 水核内，它所带的负电荷中 和了肽链上His、Lys所带的正电荷，使它 们不再与原血红素丙酸基侧链保持静电吸 引，从而使原血红素脱落。,肿瘤
16、细胞崩解,肽链与血红素之间结合力消失,血红素口袋被打开,糖 酵 解,瓦 伯 格 氏 效 应,肿瘤抑制基因失活,原癌基因的激活,羟自由基氧化损伤,超氧自由基负电荷作用,程序性铁死亡,芬 顿 氏 反 应,低氧微环境,糖酵解调节机制异常,线粒体氧化磷酸化功能损害,原血红素释放,利用荧光染料DCFH-DA（2,7-二氯荧光黄双 乙酸盐）进行活性氧检测。DCFH-DA本身没有 荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可 以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不 能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞 内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生 成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细 胞内活性氧的水平。此实验证明肿瘤细胞活性氧 明显增高。,中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所 戴宇飞教授等用正丁醇抽取原血红素辅基，再进行 Sepha
