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1、第六节 原核生物的基因重组,基因重组（gene recombination）： 将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组(gene recombination)或遗传重组。 重组：遗传物质在分子水平上发生的交换； 杂交：在细胞水平上遗传物质的交换. 杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。,原核生物的基因重组类型,4种形式：1）转化 2）转导 3）接合 4）原生质体融合,一、 转化（transformation）,定义：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段, 并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性
2、状的现象。,转化子（ transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细胞称为转化子，即转化成功的菌落。,目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力 此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。,自然遗传转化（natural genetic transformation）,人工转化（artificial transformation）,感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源DNA能力的细胞,1. 感受态,感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环境条件的影响
3、也很大，因而表现差别很大。,感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。,自然感受态与人工感受态的不同？,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性 （如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期） 受细菌自身的基因控制,人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,（1）建立了感受态的受体细胞,（2）外源游离DNA分子,感受态的机理研究：,局部原生质体化假说： 处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经
4、膜进入菌体。,酶受体假说： 受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。,2. 转化模型,（1）转化因子 本质是离体的DNA片断或质粒DNA 。转化因子进入细胞前还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA. 革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNA形式的转化因子，但进入细胞后需经酶解为ssDNA，才能与受体菌的基因组整合； 革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNA的一条链必须在胞外降解，只有ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。 但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。 由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限
5、（如肺炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并干扰转化作用。 质粒DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。 转化的频率通常为0.11，最高为20。,(2) 转化过程,肺炎链球菌转化的主要过程,转化因子进入细胞,转化因子单链配对与整合,复制,分离,自然转化过程的特点：,a）对核酸酶敏感；,c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA） 给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；,d）通常情况下质粒的自然转化形成转化子效率要低得多；,提高质粒的自然转化效率的二种方法： 1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；
6、2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转 化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救,b）不需要活的DNA给体细胞；,定义：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。,4. 转染(transfection)：,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入微生物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,5、人工转化,用CaCl2处理细胞，PEG介导、电穿孔、基因枪法等是常用的人工转化手段（使细胞膜更易于透过DNA ）。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因
7、所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高（不像线型DNA 那样易于降解，而且还能在宿主中复制。任何来源的DNA 将其连接到质粒上都能进入受体细胞）.,二、转导（transduction）,转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体 细胞称为转导子 （transductant） 携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为 转导噬菌体。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,1、
8、普遍性转导（generalized transduction）,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。,(1) 意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外 的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌LT22A(trp-)（P22）和LT2(his-)进行实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A(trp-)是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株LT2(his
9、-)是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致 一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的 P22噬菌体介导的(在接种LT22A的一端出现了原养型),（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,(2) 转导模型,转导噬菌体为什么“错” 将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点 并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳， 形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。,因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同， 利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8,
10、形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的，也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制，并在宿主基因组完全降解以前进行包装。,普遍性转导的基本要求：,普遍性转导的三种后果：,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体 的重组交换而形成稳定的转导子,流产转导（abortive transduction）,转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，转导失败。,如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导.,2. 局限转导（re
11、stricted transduction） 定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因 组整合、重组，形成转导子的现象。 媒介： 部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被 同等长度的宿主基因所取代） 只能转导个别特定基因,大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程,低频转导（LFT）的定义: 诱导溶源性大肠杆菌而产生的细胞裂解产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数（10-6）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导溶源性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导频率不过10-6 ，称为低频转导。,高频转导(HFT): 如果细菌染色体中整合有一个正常的噬菌体
12、时， 缺陷噬菌体也能整合到同一细菌染色体上（因为正常噬菌体整合后，产生两个细菌/噬菌体杂合att位点，缺陷噬菌体可以在该位点插入），这种细菌称为双重溶源菌. 双重溶源菌中，正常噬菌体称为辅助噬菌体，因为它帮助缺陷噬菌体整合和繁殖。 双重溶原菌在紫外辐射等因子的诱导下,原噬菌体容易被切割下来，产生等量的缺陷噬菌体和正常噬菌体，该裂解物称为高频率转导裂解物，用这样的裂解物去感染细菌，将比低频率转导裂解物产生多得多的转导子。这一过程称为高频转导。,大肠杆菌的低频转导和高频转导比较： uv E.coli K12() LFT 裂解物 dg(10-5 10-6) 转导噬菌体 uv E.coli K12(/
13、dg) HFT裂解物 50% (双重溶源菌) 50%dg转导噬菌体 低频率转导（LFT） ： LFT裂解物 E.coli gal- E.coli gal- / dgal+ （极少量转导子菌落) E.coli gal- 高频率转导(HFT) ： HFT裂解物 E.coli gal- E.coli gal- / dgal+ （ 50% 转导子菌落) E.coli gal-（50%）,普遍转导与局限转导的特性比较,溶源转变（lysogenic conversion）：,一个与转导相似又不同的现象,定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。
14、,溶源转变与转导的不同？,a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,三、 接合 (conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1.接合现象的发现和证实,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落 是两菌株之间发生了遗传交换 和重组所致！,为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的 “U”型管实验（ Bernar
15、d Davis，1950 ）,2. 能进行接合的微生物种类,主要在细菌和放线菌中存在。 在细菌中，G 细菌尤为普遍，如E. coli、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、固氮菌属和假单胞菌属等； 放线菌中，以链霉菌属和诺卡氏菌属最为常见，其中研究得最为详细的是天蓝色链霉菌（Streptomyces coeilcolor ）。 在不同属的一些菌种之间也可发生接合现象，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或沙门氏菌与痢疾志贺氏菌间。 在所有对象中，接合现象研究得最多、了解得最清楚的是E. coli 。E. coli 是有性别分化的，决定性别的是其中的F质粒，F质粒还是合成性菌毛基因的载体。,3. 大肠杆菌的接合型与接合,细菌遗传重组单向过程和F因子的提出 F菌株,F菌株,Hfr菌株,F因子结构图: 相对分子质量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。 图中黄色区域表示转座子，通过这些部位可以整合进细菌染色体上形成各种Hfr菌株。,Hfr菌株: 细胞中的F质粒整合到核染色体组上, 与F 菌株相接合后，发生基因重组的频率比任何已知的F 与F 接合后的频率高出几百倍，这种“雄性”菌株称为Hfr。,在Hfr菌株与F-细胞进行接合时, OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产
