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1、细胞凋亡与疾病,四、细胞凋亡与疾病,三、细胞凋亡的发生机制,二、细胞凋亡过程与调控,一、概述,五、细胞凋亡在疾病防治中的意义,一、概述,（一）研究背景,人们研究细胞的发育、分化和成熟至今已有百余年的历史，近二十年才发展到在分子水平上研究相关基因的表达调控。和细胞增殖一样，细胞死亡规律的研究一直被人们所忽视。 可寻的研究：,1858年，Virchow提出细胞死亡在动脉瘤中的重要性，并将它简单地定义为细胞退化（degeneration）、坏疽（mortification）、软化（softening）和坏死（necrosis）。,1885年，Flemming在退行性卵巢囊泡中观察到染色质凝聚成半月形
2、和细胞核渐进性退化、消失等现象，并称之为“染色质裂解”（chromatolysis）。,1914年，Graper进一步提出机体内必定存在和有丝分裂为敌的平衡机制，而“染色质裂解”的意义就在于生理性清除细胞。,1951年，Glucksman发现细胞在生物发育中的特定时空内发生死亡，并提出程序化细胞死亡（programmed cell death）的概念。,20年后，Kerr发现结扎门静脉诱导肝细胞缺血后，出现肝萎缩现象，他将它称为“固缩性坏死”（shrinkage necrosis）。,1972年，Kerr，Wyllie和Currie等正式以细胞凋亡（apoptosis）命名这种特殊的细胞死亡形
3、式。,19761981年间，三个小组分别发现淋巴细胞凋亡伴随典型的“梯样”DNA电泳图谱。,1984年，Wyllie进一步提出细胞凋亡伴随内源性核酸酶的激活。,20世纪80年代末期，生命科学家逐渐认识到 细胞死亡，特别是程序化细胞死亡特殊的生物 学意义，引起众多学者的广泛关注，形成一个 新的研究热点，并以惊人的速度取得新进展.,（二）概念,细胞凋亡（apoptosis）由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，又称程序性细胞死亡（PCD）。,Apoptosis源自希腊语，意为“花瓣或树叶的凋谢枯落”，细胞像秋天树叶凋谢一样，一定的生理或病理条件下，遵循自身所定程序结束生命的过程
4、，细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡。 .有学者认为凋亡是形态学概念，程序性死亡是功能性概念。,（三）与细胞坏死的区别,细胞坏死是由强烈损伤因素作用下（缺氧、毒物、强酸、强碱等）细胞死亡，正常组织不发生细胞坏死，细胞凋亡为生理性、主动的细胞死亡。,（四）细胞凋亡的意义,1、确保机体正常发育、生长,2、维持内环境稳定,3、发挥积极的防御功能,二、细胞凋亡过程与调控,（一）细胞凋亡过程,1、凋亡信号转导,2、凋亡基因激活,3、细胞凋亡执行,4、凋亡细胞的清除,诱导期 效应期 降解期,（二）凋亡时细胞主要变化,1、细胞形态学变化,胞膜逐渐脱离与周围细胞的接触 空泡化 胞体缩小 固缩 内质网与胞膜融
5、合,在膜表面突起出芽 染色质深缩成团，分布于膜边缘边集 胞膜皱缩、内陷，分割胞浆，蛋白浓染形 成凋亡小体,凋亡小体被邻近细胞吞噬、清除（主要是巨噬细胞）凋亡过程不导致周围组织损伤和炎症反应,2、细胞凋亡的生化改变,（1）DNA片段化 DNA链上每隔200个核苷酸有1个核小体，核小体之间的连接区易受内切酶的切割而断裂，当在核小体连接区切开DNA时，可形成200bp或整倍数的片段，在凝胶电泳中呈“梯”状。,（2）内源性核酸内切酶激活 该酶由细胞内信号转导环节被激活，在细胞凋亡过程中执行染色质DNA切割任务,（3）凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用 凋亡蛋白酶是一组对底物天冬氨酸部位有特异
6、性水解作用，活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）,有人在研究无脊椎动物如线虫细胞凋亡时发现，细胞的死亡呈现严格的特异性，在雌雄同体发育产生的1090个体细胞中，131个细胞在特定的时空内以凋亡而终结，这些细胞凋亡至少受14个基因的调控，其中最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。它们诱导和调控细胞凋亡的基本机制：Ced-3是具严格底物特异性的半胱氨酸蛋白酶，诱导细胞的特征性形态学和生化学变化。,Ced-3能结合Ced-4，后者能结合Ced-9。在活细胞，Ced-9以Ced-4为中介和Ced-3结合成三体复合物，扣押Ced-3使其以无活性
7、的酶原形式存在于细胞内，在凋亡诱导信号的作用下，Ced-9自复合物中解离。其结果是导致Ced-3的活化和细胞凋亡。如Ced-3和Ced-9在人体的类似物分别代两大家族，即caspases家族和Bcl-2家族.,人体细胞凋亡要比线虫细胞调亡的机制复杂得多。差别可能在于线粒体在哺乳细胞凋亡中的重要性。哺乳细胞凋亡主要包括两条途径，即死亡受体途径和线粒体途径。它们通过一系列分子和生物化学途径导致两条途径共同的“中央处理器”分子即caspases的活化，并诱导许多细胞核和细胞浆内相关底物的降解。,93年有人发现Ced-3基因与哺乳动物白介素1转化酶ICE功能和序列相似，和Ced-3一样，ICE高表达可
8、致成纤维细胞凋亡，之后，许多实验室致力于识别ICE/Ced-3样蛋白，至今已发现14个ICE/Ced-3家族成员（分为三组），其中一些参于细胞凋亡，一些参于细胞因子加工和炎症，为避免命名上混乱，96年专门小组推荐ICE/Ced-3家族成员统一命名天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，并按先后为序在caspase后加阿拉伯数字表示。,其在凋亡中作用： 灭活细胞凋亡抑制物（如Bcl-2） 水解细胞的蛋白结构，导致细胞解体 凋亡小体； 在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使 该蛋白另具功能等。,Caspase 的天然抑制剂：病毒性蛋白、p35，抑制蛋白-抑制Caspase活化，凋亡蛋白抑制因子IAP等,（三）
9、细胞凋亡的调控,1、细胞凋亡相关因素,（1）诱导性因素,细胞外诱导因素启动细胞凋亡程序， 使细胞趋于死亡,激素与生长因子失衡 强烈应激使糖皮质激素分泌，可诱导淋巴细胞凋亡,理化因素 OFR增加，细胞处氧化应激 状态，DNA受损，细胞凋亡,免疫性因素 免疫细胞可分泌免疫分子，参于免疫细胞或靶细胞的凋亡,生物因素 细菌、病毒及其毒素可 诱导细胞凋亡,（2）抑制性因素,某些细胞因子、激素具有抑制细胞凋 亡的作用，如IL-2、NGF、ACTH、睾酮、 雌激素等可抑制相应的靶细胞凋亡，防 止其萎缩。,某些二价阳离子（Zn+）药物（苯 巴比妥）病毒（EB）、中性氨基酸亦具 抑制细胞凋亡作用。,2、细胞凋亡
10、信号转导,凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与DNA片段化断裂及最终激活细胞死亡程序，导致细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是：多样性：即不同种类的细胞有不同的信号转导系统；,偶联性：即死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉；因此同一个信号，在不同条件下既可引起凋亡，也可刺激增殖； 同一性：即不同的凋亡诱导因素可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡。多途径：即同一凋亡诱导因素可经过多条信号转导途径触发凋亡。,（1）死亡因子介导的细胞凋亡 TNF受体家族至少12个成员，为I型膜蛋白。TNF受体家族中的Fas蛋白（膜受体）可与淋巴细胞表面Fas配体（Fas
11、ligand）或抗Fas抗体结合 以三聚体形式与邻细胞的fas结合，并诱导受体的三聚化，激活的受体通过与多种具有死亡域的受体连接蛋白结合，形成死亡诱导信号复合体（DISC），同时激活caspase级联反应，诱发细胞凋亡。 TNF被称为死亡因子（death factor）, 作用的受体被称为死亡受体（DR）。同受体结合后通过些接头蛋白活化caspase导致细胞凋亡,（3） cAMP/PKA 信号系统 糖皮质激素淋巴细胞 Ca+/Ca+调蛋白 cAMP PKA 细胞凋亡,（2） 胞内Ca+信号系统: 胞内Ca+ (+) Ca+ 依赖性谷氨酰胺转移酶 活化转录因子 细胞凋亡,（4）神经酰胺介导的细胞
12、凋亡 神经酰胺是 细胞凋亡信号调控中的第二信使分子，许多诱 导和刺激因素能激活细胞膜上神经鞘磷脂酶， 引起细胞膜上神经鞘磷脂水解产生神经酰胺。 有人用维生素D3处理HL-60白血病细胞后，该 细胞出现早期的和可逆的神经鞘磷脂水解，同 时伴有神经酰胺升高，随后发生细胞凋亡。,抗肿瘤药物红必霉素可激活神经酰胺合 成酶引起神经酰胺升高，诱导细胞凋亡。,许多刺激因子如TNF、Fas、离子射线、 IL-1、免疫分子、热休克蛋白、激素、 抗癌药（红必霉素、长春碱）和活性氧 等能激活神经鞘磷脂产生神经酰胺，诱 导多种细胞发生凋亡。,神经酰氨 鞘氨醇 1磷酸鞘氨醇（SPP),传递增殖信号,抗凋亡,细胞凋亡,水
13、解 激酶,（6）PTK信号系统 对细胞凋亡起负调控作用，神经、表皮生 长因子与其受体结合，激活该系统，促进 细胞分化。阻断该途径引起细胞凋亡。,（5）二酰甘油/PKC 信号系统 激活的PKC可引起白血病细胞发生凋亡,（7）p53+基因触发的细胞凋亡 p53在射线 所致的、化学损伤的DNA损伤和生存必需因子短 缺等触发细胞凋亡过程中起重要作用。也参与 病毒感染、细胞癌基因异常表达或某些肿瘤抑 制基因产物缺乏所诱发的凋亡。 p53可使Bax表 达增加，促进凋亡发生,（8）线粒体损伤启动的细胞凋亡 1993年Jacobson等人发现用溴化乙锭除去线粒 体DNA，诱导人成纤维细胞凋亡，表明线粒体 在细
14、胞凋亡中起重要作用，在细胞凋亡中线粒 体功能损伤表现为：线粒体膜通透性增高，内 膜的跨膜电位下降，能量合成水平显著降低 等，从而启动细胞凋亡。,3、调亡相关基因及调控,细胞凋亡是级联式基因表达的结果，已知细胞凋亡相关基因多达数十种，根据其功能不同，分为三大类：抑制凋亡基因，例如Bcl-2、EIB和IAP；促进凋亡的基因，例如p53、Fas等；双向调控基因，例如c-myc、Bclx。正常情况下前二类基因处于动态的平衡，以确保细胞生死有序。目前已发现多种基因编码的产物参与了调亡的发生和调控，研究得较多的是Bcl-2、p53等。,（1）Bcl-2 是B细胞瘤/白血病-2的基因缩 写，是讫今研究的最深
15、入、广泛的抑制凋亡基 因之一，最早从小鼠B细胞瘤中分离出来，是 一种细胞内膜蛋白，主要定位于线粒体、内质 网、核膜。至今已相继发现至少20个存在于哺 乳动物的Bcl-2同源蛋白。其中，一些属于凋亡 抑制蛋白如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-G等， 一些则具有凋亡诱导活性如Bax、Bak、Bid、 Bim、Bik、Bcl-B、Bcl-Xs等。,Bcl-2家族成员主要包含两大结构域，即位于 羧基端的跨膜结构域（TM）和数量不等（14个） 的Bcl-2同源结构域（Bcl-2 homology，BH）。根 据结构特点的不同，Bcl-2家族可划分为三个分别 以Bcl-2;Bax和BH3-o
16、nly域蛋白（Bik）为代表的亚类。,Bax由192氨基酸组成，与Bcl-2的同源性为21%，Bcl-2与Bax在体内可形成异二聚体，但Bax与Bcl-2的作用完全相反，Bax/Bax二聚体在体内过量表达时，可促进细胞凋亡，而Bcl-2的抑制凋亡功能可能通过与Bax形成异二聚体而实现。Bcl-2家族可决定细胞生死存亡。,Bcl-2高表达可导致肿瘤细胞对射线、抗癌药物的耐受性增强。,Bcl-2抗凋亡机制： 直接抗氧化； 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质； 抑制凋亡诱导蛋白Bax、Bak的细胞毒作用； 抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活； 维持细胞钙稳态。,（2）Fas Fas基因对细胞凋亡有促进作用，Fas与其配体（Fasl）的相互作用是引起细胞凋亡的主要途径之一。Fas蛋白属于TNF受体家族，Fas与其细胞表面配体Fasl的结合，可诱导酪氨酸激酶活化使多种细胞蛋白的酪氨酸磷酸化，介导DNA裂解。,有资料表明外周血T、B细胞中，Bcl-2的表达下降，而Fas表达显著升高，提出Bcl
