打破DNA的物种界限课件

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1、1355, 17 打破DNA的物种界限基因工程,目录,1356,基因重组（genetic recombination） 指一段DNA在细胞内或细胞间，甚至在不同个体或物种之间进行交换，并能在新的位置上复制或转录，乃至翻译。,天然重组：接合、转化、转导、位点特异性 重组、转座重组、同源重组。 人工重组：基因工程或重组DNA技术。,目录,1357,17.1 基因的天然重组,接合作用 (conjugation),转化作用 (transformation),转导作用 (transduction),转座重组(transposition),同源重组 (homologous recombination),位

2、点特异的重组(site-specific recombination),目录,1358,17.1.1 接合作用(conjugation),通常发生在细菌之间，指细菌通过性菌毛相互接触时，遗传物质从一个细菌转移至另一细菌的过程。,质粒：可接合质粒如 F 因子(F factor)。,目录,1359,目录,1360,接合过程,1361,17.1.2 转化作用（transformation）,指受体细胞通过获取外源DNA而获得新的遗传性状的过程，其通常发生于原核细胞。,目录,1362,肺炎球菌转化实验,目录,1363,17.1.3 转导作用,通常指借助噬菌体感染而将供体菌的DNA转移并重组到受体菌的染

3、色体DNA上的过程。转导作用包括普遍性转导（generalized transduction）和特异性转导（specialized transduction） 。,目录,1364,普遍性转导,目录,特异性转导,1365,（1）,（2）,（3）,（4）,目录,普遍性转导（ generalized transduction ）,1366,（1）,（2）,（3）,（4）,（5）,（6）,目录,特异性转导（ specialized transduction ）,1367,17.1.4 位点特异重组,位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列

4、的特异位点间发生的整合。 特点：在供体与受体的特定位点的短同源序列之间，DNA精确切割， 连接。 DNA不丢失、不合成、不交换对等部分（有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重组），需要位点专一性的蛋白质因子参与。,目录,1368,例1：噬菌体DNA的整合,目录,1369,例2：沙门氏菌H片段的倒位重组,目录,1370,例3：免疫球蛋白基因的VDJ重排,目录,1371,17.1.5 转座重组,转座是一种特殊的遗传重组，它是将特定的遗传因子从DNA上的一个地方移位到另一个地方。,目录,1372,目录,1373,插入序列(insertion sequences, IS)组成 二个

5、分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因,转座子组成 反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因,转座子(transposons) 除IS外，还含有抗生素抗性基因。,目录,1374,A. 插入序列 B. 转座子,目录,1375,转座的形式： 保守性转座(conservative transposition)、 复制性转座(duplicative transposition)。,目录,1376,17.1.6 同源重组,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombinatio

6、n)，又称基本重组，是最基本的DNA重组方式。 通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 条件：2个DNA分子序列同源，且同源区域越长越有利（至少75bp以上）。,目录,1377,同源重组的Holliday模型,两个同源染色体DNA排列整齐； 一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体(holliday junction)； 通过分支移动(branch migration)产生异源双链DNA (heteroduplex DNA)； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch

7、 recombinant) 拼接重组体(splice recombinant),目录,1378,目录,1379,片段重组体： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,目录,1380,同源重组的生物学意义,维持种群的遗传多样性。 有助于DNA的损伤修复。 有助于真核细胞减数分裂染色体正确分离。 为基因打靶技术和基因敲除/敲入动物模型的建立奠定了理论基础。,目录,1381,基因敲除（gene knockout）：利用同源重组原理，有目的地去除（敲除）实验动物体内某特定基因

8、的技术，以用于观察目的基因的功能。,构建同源重组载体； 导入胚胎干细胞（embryo stem cells，ES）； 通过同源重组敲除原有基因； 将敲除成功的ES细胞转入小鼠囊胚（blastocyst）中参与胚胎发育； 合理培育，筛选出两个等位基因都被敲除的纯合子小鼠； 观察、研究小鼠的表型变化。,步骤：,目录,1382,目录,HSV-tk,neot,1383,17.2 基因的人工重组,又称重组DNA技术（recombinant DNA technology）或分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）。是实现基因克隆所用的方法及相关工作的总称，所有相

9、关的技术都被称为基因工程(genetic engineering)。,目录,1384,基本过程：在体外将目的DNA片段与能自主复制的载体连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。 克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。,目录,1385,基因工程：重组DNA技术的产业化设计与应用,基因工程广义概念,上游技术 外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（重组DNA技术）称为狭义的基因工程,下游技术 含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大

10、规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。,目录,1386,（1）基因工程技术诞生的理论基础（1865-1970s） 1865年：Mendel的豌豆杂交试验。 1944年：Avery的肺炎球菌转化实验。 20世纪50年代：Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构；Meselson和Stahl证实了DNA的半保留复制。 20世纪60年代：Crick提出了“中心法则” ；Brenner&Crick提出3联密码子学说；Nirenberg、Mattaei、Khorana破译了遗传密码。,17.2.1 基因工程的建立与完善,目录,1387,（2）基因工程的诞生（19721976年） 20世

11、纪70年代初，人们发现了限制性核酸内切酶、DNA连接酶和可作为基因工程载体的细菌质粒，使基因工程从理论走向实践。 1972年：Berg 用EcoR分别酶切猿猴病毒SV40 DNA和噬菌体DNA并用连接酶将之连接起来, 第一个重组DNA分子诞生。 1973年：Cohen将酶切的DNA分子与质粒连接，并将其转化入E.coli。 至1976年：相关科学家完成了DNA重组相关的载体与受体细胞的安全性改造。,Paul Berg,目录,1388,（3）基因工程技术的成熟（1977-1980) 1977年，Itakura等人首次在大肠杆菌中表达了人的生长抑素基因；Ullrich等人克隆并表达了人的胰岛素基因

12、。 1978年，美国Genetech公司开发出重组大肠杆菌合成人胰岛素的生产工艺，拉开了基因工程产业化的序幕。,目录,1389,（4）基因工程技术的腾飞（1980-至今) 1982年：转基因小鼠。 1983年：转基因植物技术的建立。 1990年：基因治疗技术用于临床。 1991年：人类基因组计划正式启动。 1996年：体细胞克隆羊Dolly诞生。,目录,Ian Wilmut and “Dolly”,1390,让人类拥有上帝之手的技术,基因工程,目录,1391,17.2.2 基因工程技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 末端转移酶 DNA连接酶 多核苷酸激酶 碱性磷酸酶,目录,13

13、92,基因工程技术中常用的工具酶,目录,1393,GATCC,+,Bam H,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE),简称限制性内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子中某些特定核苷酸序列，并在识别位点或周围特异性切割DNA双链的核酸内切酶。,17.2.2.1 限制性核酸内切酶,目录,G,1394,限制性内切酶的发现,W. Arber，1965年记录到从大肠杆菌C株中提取的噬菌体DNA，进入K株后被降解。,D. Nathans进一步证实了W. Arber关于限制性内切酶的存在。,H.O.Smith 等1970年从流感嗜血杆菌Rd株分离到了Hind，这是第

14、一个分离到的类限制性内切酶。,三人共同获得1978年诺贝尔奖,现已从超过230种细菌中分离出900种以上的限制酶。,早在19世纪50年代，就有研究者从噬菌体与大肠杆菌的关系中发现了限制与修饰现象。,目录,1395,限制/修饰系统（restriction/modification system) 细菌的免疫体系辨认自己的DNA和外来的DNA，并使后者降解掉。,切割破坏外源DNA 限制作用：限制酶。 识别保护自身DNA 修饰作用：甲基化酶。,目录,1396,M,M,细菌的限制修饰系统,限制性核酸内切酶,修饰酶：甲基化酶,目录,1397,（1）分类：分为、型三大类 型：属于复合功能酶，兼有修饰和切割

15、DNA两种特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作为催化的辅因子，在DNA降解时伴随有ATP的水解。即它具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。若识别位点上两条DNA链均未甲基化，则行使内切酶功能，并在切割DNA同时或以后转变为ATP酶；若位点上只有1条链被甲基化则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点上两条链均甲基化，就与位点解离。其显著特点是识别位点和切割部位不一致，无固定切割位点，一般在识别位点以外的1kb（不少于400bp）到几kb（可多达7kb）处随机切割，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。 型：与型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA

16、解旋酶活力。不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程的意义也不大。,目录,1398,型：与型、型限制酶不同，型限制酶的相对分子质量一般小于105000，并通常以同源二聚体形式存在。型限制酶不需ATP供能，但需Mg2+参与，其能在DNA双链内部的特异位点识别并精确切割DNA（识别和切割位点一致），产生特异性的酶解DNA片段，故其在基因工程中应用广泛。因此，通常所说的限制性内切酶就是指型限制酶。,目录,DNA双链,黏性末端,限制性内切酶,1399,Hemophilus influenzae d(strain) 嗜血杆菌属流感菌种d株的第三个被发现的酶,（2）命名,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母代表株（大写或小写）； 罗马数字表示发现的先后次序。,目录,1400,（3）型限制性内切酶识别和切割的位点,1）位点特异：通常为6或4碱基序列（有些为8个 或更多碱基序