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1、江南大学,1,代谢组学-方法与应用 授课教师 ：吴敬 教授 授课时间：2009年11月,江南大学,2,“基因组学反映了什么是可以发生的，转录组学反映的是将要发生的，蛋白质组学指出了赖以发生的，只有代谢组学才真正反映业已发生的。” 许国旺,江南大学,3,第一章 代谢组学的简介 第二章 代谢组学的研究方法 第四章 代谢组学的应用 第五章 代谢组学的发展前景,江南大学,4,组学时代4种最重要的组学,江南大学,5,代谢组学（Metabonomics/ Metabolomics ）是通过考察生物体系（细胞、组织 或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的
2、变化，来研究生物体系的一门科学。 代谢组（metabolome）是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常生长功能 和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子量小于1000的内源性小分子。 代谢物数量因物种不同而差异较大： 植物（200 000种）、动物（2500种）、微生物（1500种）,江南大学,6,代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。 基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放（cell signaling），能量传递，细胞间
3、通信等都是受代谢物调控的。代谢组学正是研究代谢组（metabolome）在某一时刻细胞内所有代谢物的集合的一门学科。基因与蛋白质的表达紧密相连，而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境，这又与细胞的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其它外界因素的影响密切相关。 因此有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”（Bill Lasley, UC Davis）,江南大学,7,第一章 代谢组学简介代谢组学的发展,江南大学,8,代谢组学的特点： 关注内源化合物 对生物体系的小分子化合物进行定量定性研究 上述化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境
4、因子的影响 上述内源性化合物的知识可以被用于疾病的诊断和药物筛选 与转录组学和蛋白组学相比，代谢组学有以下优点： 基因与蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易 代谢组学的研究不需要建立全基因测序及大量序列标签（EST）的数据库 代谢物的研究种类远小于蛋白质的数目 研究中采用的技术更通用,江南大学,9,Genomics and Proteomics are not sufficient to describe reasons for toxicity or disease state 基因组学和蛋白组学对于毒性或疾病状态的描述是不足的 Neither Genomics nor
5、 Proteomics can produce time course information which is important for animal to animal comparison 基因组学和蛋白组学都不能提供动态信息，但这些信息对于动物间的比较是重要的 Metabolite profiling produces information on the biochemical pathways effected 代谢物分析能提供生化途径结果的信息 Monitoring metabolites allows concurrent or sequential affects to b
6、e monitored, e.g. blocking of a metabolic pathway in the liver can lead to toxicity in the brain (hydrazine) 代谢监控可监控即时或相继的结果，例如：阻断肝脏中代谢途径会在脑中产生毒性肼 Metabonomics, unlike the other “omics” is non-invasive 不像别的组学研究，代谢组学是无创的,The Need for Metabonomic Information,江南大学,10,代谢组学研究现状 代谢组学属于全局系统生物学（Global syste
7、ms biology）研究方法，便于对复杂体系的整体进行认识譬如，一个正常工作的人体包括“人体”本身和与之共同进化而来且共生的消化道微生物群体（或称菌群），孤立地研究“人体”本身的基因，转录子以及蛋白质当然可以为人们认识人体生物学提供重要信息，但无法提供使人体正常工作不可缺少的菌群的信息人体血液和尿液的代谢组却携带着包括菌群在内的每一个细胞的信息，因此代谢组学方法对研究如人体这样复杂的进化杂合体十分有效,江南大学,11,不同器官组织具有不同的代谢轮廓，广谱全采集,江南大学,12,代谢组学已经广泛地应用到了包括药物研发,分子生理学,分子病理学,基因功能组学,营养学,环境科学等重要领域.在代谢组学
8、诞生后的6年里,有关代谢组学的研究论文和专利以指数的形式逐年增长.,江南大学,13,代谢组学与系统生物学 系统生物学概念的诞生标志着研究哲学由还原论向整体论的变化.系统生物学的中心任务就是要针对生物系统整体(无论它是生物细胞,多细胞组织,器官还是生物整体),建立定量,普适,整体和可预测(QUIP)的认知. 具体而言,系统生物学研究就是要将给定生物系统的基因,转录,蛋白质和代谢水平所发生的事件,相关性及其对所涉及生物过程的意义进行整体性认识，从而出现了许多的组和组学的新概念.,江南大学,14,现已提出的一百多个组和组学,可以大体归纳为基因组/基因组学,转录组/转录组学,蛋白质组/蛋白质组学和代谢
9、组/代谢组学四个方面.显而易见,DNA,mRNA以及蛋白质的存在为生物过程的发生提供了物质基础(但这个过程有可能不发生!),而代谢物质所反映的是已经发生了的生物学事件.因此代谢组学是对一个生物系统进行全面认识的不可缺少的一部分,是全局系统生物学(global systems biology)的重要基础,江南大学,15,第二章 微生物代谢组学的研究方法 Challenges of MetabonomicsSample Complexity and Data Handling,Each sample has., a wide range of compound classes a wide var
10、iation in metabolite concentrations a large number of potential components,Each group of samples has, many sample analyses are required for statistical relevance a complex raw dataset that needs to be processed differences between sample groups which need to be highlighted,江南大学,16,代谢组学(metabonomicsm
11、etabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。 其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。,江南大学,17,代谢组学利用高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，动态跟踪细胞、有机体分泌出来的体液中的代谢物的整体组成，借助多变量统计方法，来辩识和解析被研究对象的生理、病理状态及其与环境因子、基因组成等的关系。 “代谢组学”是一种整体性的研究策略，其研究策略有点类似于通过分析发动机的尾气
12、成分，来研究发动机的运行规律和故障诊断等的“反向工程学”的技术思路。由于代谢组学着眼于把研究对象作为一个整体来观察和分析，也被称为“整体的系统生物学”。,江南大学,18,研究方法和步骤 样品制备：足量的代表性样品（-80保存） 2.数据采集和标志物识别：常用色谱-质谱联用 、NMR 3.数据分析： PCA、 PLS、 ANN 4.代谢途径分析：代谢轮廓分析和代谢组学分析,江南大学,19,The strategy for large scale metabonomics research,江南大学,20,样品制备 微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养、淬灭和代谢产物的提取。根据研究对象、目的
13、和采用的分析技术不同,所需的样品提取和预处理方法各异，不存在一种普适性的标准化方法。 微生物代谢组学研究要求微生物的生长条件是可以控制和重复的。在一个生物反应器中，需要严格控制温度、pH、培养基组成、溶解氧和二氧化碳等以明确界定生长条件，建立标准的和可重复的参考培养条件。微生物的培养可以以分批、补料或者连续培养模式进行。由于连续培养的菌体生理稳定，易于控制且重现性较好，所以，大多数研究者倾向于应用生物反应器连续培养操作模式。,江南大学,21,在样品淬灭和代谢物的提取过程中，应遵循的原则是： （1）淬灭工艺最好可以立即冻结细胞代谢 （2）在淬灭过程中要求细胞膜无明显损伤，以免胞内代谢物外泄。 （
14、3）提取过程中应该尽可能多的提取胞内代谢物。 （4）代谢产物不应该遇到任何物理或化学修饰。 （5）得到的样品基质应与所选择的分析方法相容。 冷甲醇、液氮和热乙醇是最常用的淬灭方法，而在提取方面由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法应该根据不同的化合物选择不同的提取方法，并对提取条件进行优化。,江南大学,22,对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的关键步骤，也是最困难和多变的步骤。 与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同，代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大，要对它们进行无
15、偏向的全面分析，单一的分离分析手段往往难以保证。 色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用于代谢组学的研究。,江南大学,23,江南大学,24,一般来说,选择代谢物组学分析方法时,其原则是要同时考虑仪器和技术的检测速度、选择性和灵敏度,找到一种最适合目标化合物的方法。 化学分析技术中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色谱质谱联用(X-MS)，如气相色谱耦联质谱(GC/MS)、液相色谱耦联质谱(LC/MS)和毛细管电泳耦联质谱联用技术 (CE/MS)来分析研究代谢物并为其绘制图谱。这些技术的耦联可以提高对样品的分辨率、敏感
16、性及选择度,有利于对更多的生物体系内的代谢物绘制图谱。,江南大学,25,GC/MS 、LC/MS和CE/MS 可以同时检测出数百种化合物，包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代谢物 。 GC/MS有很好的分离效率且相对较为经济，但需要对样品进行衍生化预处理，这一步骤会耗费额外的时间，甚至引起样品的变化。受此限制，GC/MS 无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。 近来，多维分离技术如二级气相色谱飞行时间质谱（GC-GC-TOF-MS），检测范围更广，但由于实际应用困难和花费较高等问题使其并未普遍使用。,江南大学,26,HPLC 与 GC 原理相似，但在进样前不需进行衍生化处理，适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。HPLC/MS 选择性和灵敏度都较好，但分析的时间相对较长，且需依赖纯的参照物。 CE-MS分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多，仅需要极少的进液量nL），而且其测试时间短，试剂成本低。CE-MS在微生物代谢组领域发挥着越来越
