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1、第九章 酶的蛋白质工程,蛋白质工程,蛋白质工程： 是以蛋白质空间结构及其与生物学功能的关系为基础，通过分子设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，而实现的对天然蛋白质的定向改造。 目的： 是为构造并生产性能比现有蛋白质更加符合人类需要的蛋白质新品种提供科学依据和技术途径，同时，为分子生物学的基础理论研究提供强有力的新手段。,蛋白质的结构,1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang首次提出蛋白质三级结构的概念： 一级结构：指多肽链中氨基酸的一定的顺序，靠共价键维持多肽链的连接，而不涉及其空间排列。 二级结构：指多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列。 三级结
2、构：指整个肽链的折叠情况，包括侧链的排列，也就是蛋白质分子的空间结构或三维结构。 1958年英国晶体学家Bernal提出四级结构概念： 四级结构：指蛋白质亚基的排列。,蛋白质的超二级结构和结构域,超二级结构：1973年Rossman提出，指二级 结构的组合物。 结构域：由Porter提出，是指蛋白质分子中 那些明显分开的球状部分。,蛋白质工程就是对自然界存在的蛋白质加以改造，改造的目的是得到性能更符合人类要求的非天然蛋白质，以用于工业、农业、医药卫生等各领域。,蛋白质改造的方法： 通过改造它们的基因，再用基因工程的方法由工程菌种来生产新的蛋白质。 与药物设计的关系： 近年来随着药物设计发展的需
3、要，基于生物大分子结构知识的药物设计已成为药物发展中的重要领域，由于这种设计途径在很大程度上与蛋白质工程有着深刻和广泛的联系，因此往往在学术上与蛋白质工程一起讨论。,三类专家： 蛋白质空间结构测定的专家； 蛋白质分子设计的专家； 基因工程的专家。,空间结构测定的专家： 主要应用X射线晶体结构分析的方法与技术对蛋白质分子的空间结构进行实验测定。,分子设计专家： 在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，主要通过理论的方法，提出蛋白质改性的设计方案，这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然蛋白质不同，这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的变化，从而能赋予新蛋白质什
4、么样的特性。,当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具，采用基于物理学原理的各种模拟方法和基于蛋白质的改性分子结构知识的模型构建方法，或兼用这两类方法。,基因工程专家： 在得到了新的蛋白质的改性设计方案之后，就用一套分子生物学的技术，先合成相应的基因模板，再经过克隆与表达，得到新蛋白质的产物，最后通过分离、纯化，提取出足够纯的新蛋白质以研究它的性质。,蛋白质工程的这一程序不是一次就能实现的，往往要经过多次的循环，不断改进设计方案才能发现一个理想的新改性蛋白。,当前蛋白质工程研究的热点： 一方面是对具有明显生物学功能的天然蛋白质分子； 另一方面是基于生物大分子结构知识的药物设计。,蛋白质
5、人为进化,定向进化 随机突变,生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。,天然酶的作用,利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已成为生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用。,随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定
6、性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能,天然酶的局限,天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。,现代生物工程对酶的要求,提高Vmax，减少Km,改变最适pH 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料,如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景。,1993年,美国科学家Arnold F H（加州理工大学，生物化学家）首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。,蛋白质定向进化概念的提出,人为地创造特殊的进化
7、条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。,定向进化技术,定向进化的原理,定向进化随机突变选择,随机突变的策略,易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffl
8、ing 技术,易错PCR,易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。 连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。,易错PCR：是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。 原理：通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP 的量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP 来代替被减少的dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR 缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突变率。,
9、DNA改组,DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)，即将DNA拆散后重排。它是模仿自然进化的一种DNA 体外随机突变方法。,这种方法不仅可以对一种基因人为进化，而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组，共同进化出一种新的蛋白质。,1.目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因； 2.DNaseI酶切：将基因随机切割成约10-50bp或300bp 左右的小片段； 3.不加引物的PCR：在Taq 酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组； 4.加引物的PCR：
10、加入目的基因片段两端的引物，使连接好的DNA 得到扩增，筛选正突变,得到的正突变子又可以重复进行DNA shuffling。,DNA shuffling基本过程包括四个步骤：,体外随机引发重组,体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。,交错延伸,交错延伸(stagger extensionprocess,S
11、tEP)PCR是在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。,定向进化的筛选策略,琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，
12、逐个通过流式细胞计数仪进行测定。,突变体分离,通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测,酶检测,信号探测,分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁,定向进化与自然进化的异同点,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：,进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质
13、在顺序空间的可及性。,定向进化技术,定向进化的应用,蛋白质工程改造的实际应用,枯草芽孢杆菌蛋白酶：,一种丝氨酸蛋白酶，是工业上应用很广的酶，在 洗涤剂、制革、丝绸等多种行业上有广泛的用途。,分子量较小，27.5kDa，功能研究的比较清楚， 产生菌的基因也已经被克隆，并已建立合适的表 达载体系统，是蛋白质工程的理想的研究对象。,(succinyl)-Ala-Ala-Pro-X-p-二硝基苯胺,展望,总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。 随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。,本 章 小 结,酶的蛋白质工程概念？ 酶的定向进化？ 随机突变的方法有哪些？ 酶的蛋白质工程的目标？,
