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1、1.2 基因工程的基本操作程序,目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,例子?,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(一)从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？种类？如何构建？,一、目的基因的获取,基因组文库,cDNA文库,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,种类：,基因组文库,cDNA文库,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编
2、码区下游,启动子,终止子,与RNA聚合酶结合位点,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞 基因结构,不编码蛋白质。,调控遗传信息表达,上游有启动 子，下游有终止子,真核细胞 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：调控，上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合 酶结合位点,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,(一)从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？种类？如何构建？ 2.怎样从基因文库中得到
3、我们所需的目的基因？,一、目的基因的获取,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。,1有关目的基因的获取和基因文库的理解，不正确的是() A目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成 B目的基因主要指编码蛋白质的结构基因 C基因文库就是基因组文库 DcDNA文库只含有某种生物的一部分基因,2下列属于获取目的基因方法的是 利用mRNA反转录形成从基因文库中获取 从受体细胞中提取 利用PCR技术扩增 利用DNA转录 人工合成 A B C D,D,C,(二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术多聚酶链
4、式反应,原理： 前提： 条件：,DNA双链复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制,一、目的基因的获取,复习：,1、目的基因？,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,3、什么是基因文库？种类？,5、原核细胞与真核细胞的基因结构？,6、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,4、基因组文库？ cDNA文库？,变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,退火,变性,延伸,(二）
5、利用PCR技术扩增目的基因,(三) 通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成,一、目的基因的获取,前提：基因比较小，核苷酸序列已知。,是获取目的基因的最方便方法,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、多聚酶链式反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,A,D,3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应 的内容，正确的组合是,C,4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其
6、中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个,B,5、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人
7、工合成,二、基因表达载体的构建（核心）,(1)用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 (2)用_切断目 的基因，使其产生_ _。,(3)将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1、目的： 2、过程：,基因表达载体的组成：,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D启动子是与RN
8、A聚合酶识别和结合的部位，是起始密码,D,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,三、将目的基因导入受体细胞,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体
9、动植物细胞 A B C D,B,D,3. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A B C D,C,4. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法 A B C D,C,四、目的基因的检测与鉴定,检测,鉴定,是否插入了目的基因,是否转录出了mRNA,是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗
10、病鉴定 活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,mRNA与DNA分子杂交,抗原-抗体杂交,个体生物学水平的鉴定,知识延伸DNA分子杂交技术,标记,待检测,1.比较载体与基因表达载体的区别。 2.切割DNA获取目的基因和切割载体时一般情况下为什么 要选用同一种限制性核酸内切酶？经过重组过程后会形 成几种DNA分子？ 3.分析为什么动物的受体细胞不能为体细胞？ 4.讨论大肠杆菌细胞转化时为什么要用Ca2+处理细胞。 5.目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内稳定保存的实 质是什么？ 6.基因探针的实质是什么？ 7.若使农杆菌也能感染单子叶植物，应如何操作？ 8.基因工程操作的四个步骤中，有哪几
11、个步骤涉及到碱基 互补配对？,小结: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射技术、感受态细胞 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定,1.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 2. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细
12、胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,B,D,3.哪项不是基因表达载体的组成部分 A.启动子 B.终止密码子 C.标记基因 D.目的基因 4.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,B,B,5、有关基因工程的叙述中，错误的是 A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,6.将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是 A.每个大肠
13、杆菌细胞至少含一个重组质粒 B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada D.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子,C,7.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的应用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：,(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆菌能在自然条件下感染植物的特点，能实现_。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的_上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_(部位)即可。 (2)根据T-D
14、NA这一转移特点，猜测该DNA片段上可能含有控制_ (酶)合成的基因。 (3)图中c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是_ _类化合物。 (4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取_。(至少写出两种),单子叶植物,目的基因导入到植物细胞,染色体DNA,T-DNA片段(内部),DNA连接酶、限制酶,酚,基因枪法、花粉管通道法,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法,三、将目的基因导入受体细胞,花粉管通道法,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,三、将目的基因导入受体细胞,基因枪法,2、将目的基因导入动物细胞,显微注射法,目的基因表达载体提纯 取卵（受
15、精卵） 显微注射受精卵 移植到输卵管或子宫 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,处理物质：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,Ca2+处理,大肠杆菌,繁殖快、 多为单细胞、 遗传物质相对少,过程：,思考与探究：,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠
