第八章目的基因的表达课件

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1、第八章 目的基因的表达,第一节 基因工程中的基因表达,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。在构建重组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。 要求外来的基因在宿主细胞中能够准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在宿主细胞中不被分解，而且最好还能分泌到细胞外。,不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到目的基因的表达问题。,当基因工程的目的为研究基因结构与功能的关系时，需将天然的或人工突变的基因片段插入含有一定报告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因对表达水平的

2、影响，从而分析目的基因的结构与功能的关系。,外源基因是否插入在正确的阅读框架； 目的基因的有效转录（如启动子的作用）； mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）； 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程。,制约目的基因表达的因素,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,阅读框架是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中。 构建一组载体，使每个载体与相对于起始密码ATG的转译位相的位点不同，分别与外源目的基因拼接，即可获得所有可能的三位位相，其中必有一种位相可以保

3、证外源基因处于正确的阅读框架中。,用人工接头可以调节阅读框架。市售的同一酶切点的人工接头一般都有三种长度，经与DNA片段连接，并切割成黏性末端后，各相差一个核苷酸。 因此，选择适当的人工接头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。,为了使外源基因表达，需要在基因编码顺序的5端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺序。 两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达： 1) 在形成重组体DNA分子时，载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。 2) 将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产生一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯后，还要

4、准确地将两部分分开，才能获得所需要的蛋白质。,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚合酶有效识别。,Roberts等(1979)构建了一系列重组质粒，各种质粒之间的区别仅在于启动子和结构基因cro之间的距离不同。将这些不同的重组质粒转化大肠杆菌后，发现cro蛋白质的水平在重组质粒间相差悬殊，最高值比最低值大2000倍。,启动子与结构基因之间的距离在蛋白质翻译上有巨大作用。,启动子有强弱之分，强启动子指导

5、产生较多量的mRNA，弱启动子指导下转录合成的mRNA很少。启动子的强度主要决定于启动子的结构。 在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子)以及tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 为了在原核细胞中表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才能在原核表达系统中被转录。,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质； 在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从

6、而降低了转译的效率； 偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因启动子所开始的转录干扰另一个必要的基因或调节基因的转译。,克隆基因末端的转录终止区的存在，可避免以下几种不利现象：,有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降。 所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数（也就是基因的表达效率）控制在一个正常的水平上。,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,原核细胞在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。,影响翻译效率的因素主要有：,1) SD序列与rR

7、NA的16S亚基3端序列的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。,2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。,连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变也会对转译效率发生很大的影响。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50或25。,3) 起始密码之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响；直接位于起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样会对转译的效率发生影响。,例如-半乳糖苷酶的转译，当AUG左侧的密码三联体为UAU或CUU时，其转译最为有效；而如果是UU

8、C，UCA或AGG，那么它的转译水平将下降20倍。,4)翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA5末端区域间的互作，这时mRNA的5末端已折叠成特殊的二级结构，基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映。,翻译的起始是决定翻译水平高低的一个重要因素。由于紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差1520倍。这主要是改善了翻译的起始和mRNA的二级结构。,5) 基因末端的转录终止区的影响。 外源末端除要安装好的启动子，还要注意终止区的设置。,第二节 大肠杆菌原核表达体系,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表

9、达效率的途径,大肠杆菌是基因工程采用最多的蛋白质表达体系。 原因是：培养方法简单、迅速、经济而又易于掌握，再加上人们运用大肠杆菌表达外源基因有三十多年的经验。,运用大肠杆菌表达外源基因，必须采用符合以下条件的载体： 含大肠杆菌适宜的选择标志； 具有能控制转录、产生大量mRNA的启动子，如lac、tac启动子等； 含适当的翻译调控序列如核糖体结合位点和翻译起始点ATG； 具多聚接头，以确保目的基因按一定方向与载体正确连接。,大肠杆菌表达体系的缺点： 表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰； 表达的蛋白质常常形成不溶性的包含体，要使其具有活性还需要经复性等处理； 很难大量表达分泌性蛋白质。

10、,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径,对于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表达的方法在大肠杆菌中表达有很多优点： 1）由于外源基因一般是被连接到可供融合的蛋白的C端编码序列之后，因此不需另外设计SD序列，同时，N端融合基因的存在，使得外源基因的表达相对比较容易。,2）外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白(如-半乳糖苷酶)的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解。,3) 通过融合表达为蛋白纯化提供便利： 将外源目的基因与一段

11、“亲和手柄”的编码序列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。 所得到的融合蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。这样，经过比较简单的几步即得到较高纯度的重组目的蛋白。,4) 通过融合表达的方式促使产物以包含体的形式表达，产物表达量往往比较高。 5) 通过融合表达使产物以可溶性的方式表达。 6) 融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三

12、、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径,某些目的蛋白在大肠杆菌的表达形式是细胞内的包含体。 外源目的基因产物在大肠杆菌宿主中有可溶性表达与包含体表达两种形式。,可以避免宿主的降解。 当以包含体表达时，目的基因产物的表达量也往往比较高， 包含体容易纯化，往往仅通过简单的差速离心及洗涤等几步即可得到较高纯度的目的蛋白。 当所表达的重组蛋白产物对宿主细胞具有毒性时，使重组目的产物以无活性的包含体形式表达可能是蛋白表达的最佳方式。,包含体表达的优点,当以包含体形式表达时，外源目的蛋白表达产物需经过变性、复性等手段才能得到有生物活性的蛋白。而提取的手段复杂，并且回收率较低。 未形

13、成包含体的水溶性活性物质在提取过程中容易损失。,包含体表达的缺点,虽然目的基因产物以包含体形式表达有不少优点，而且近年来随着蛋白复性技术研究的发展，许多目的基因产物得以通过包含体变性、复性的方法以一定的收率得到最终的产品。 然而迄今对于包含体的复性尚未有一个普遍适用的有效方法。适宜的复性条件一般都是经过实验摸索而得出，并且这些条件往往随目的蛋白的不同而不同。 另外，生产规模的包含体变性复性的产物纯化过程，其费用亦相对较高。,如何能在大肠杆菌中直接表达出已正确折叠的有生物活性的重组目的蛋白，引起众多研究者的兴趣，并成为近年来大肠杆菌表达研究的热点之一。,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表

14、达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径,为了在大肠杆菌中合成某种特殊的真核生物的蛋白质以满足商品生产的广泛需求，仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的，所以，必须设法提高克隆基因的表达效率。 许多因素诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率，因而从分析这些因素入手就能够寻找提高克隆基因表达效率的有效途径。,通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； 外源基因不能带内含子，必须用cDNA，而不能用

15、基因组DNA； 利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达； 外源基因与表达载体连接必须形成正确的开放阅读框架； 利用宿主菌的调控系统，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,1. 外源基因在原核细胞中表达必须满足的条件：,（1）启动子结构对表达效率的影响。 （2 ）转译起始序列对表达效率的影响。 （3）启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响。 （4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响。,2. 外源基因在原核细胞中高效表达需注意的因素：,限制蛋白质合成的第一步，是发生在核糖体同mRNA分子结合的过程中的。 由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是大大超量的，因此，提高克隆基

16、因表达效率的途径之一是增加相应的mRNA分子的数量。,（5）质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响,影响mRNA分子合成速率的因素有两种： 第一种是启动子的强度； 第二种是基因的拷贝数。提高基因的拷贝数(即基因的剂量)最简单的办法是，将基因克隆到高拷贝数的质粒载体上。,根据实验观察，随着重组体克隆基因表达水平的上升，寄主细胞的生长速率便会相应地下降，同时形态上也会出现一些明显的变化，例如细胞纤维化和脆弱性增加等。 如果细菌由于产生出某种突变而失去了重组质粒，或是经过结构的重排使重组基因无法再行表达，或是质粒的拷贝数大大降低，那么这样的突变菌株便会有很高的生长速度，迅速地成为培养物中的优势菌株。而具有重组质粒的寄主细胞，最终便会被“稀释”掉，使克隆基因无法得到表达。由缺陷性分配引起的质粒丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性。,（6）提高翻译水平常用的途径 调整SD序列与AUG间的距离； 用点突变的方法改变某些碱基； 增加mRNA的稳定性。 细菌的mRNA的半衰期很短，一般仅为12min，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加mRNA的稳定性，则有可能提高外源基因的表达水平。研究表明，大肠杆