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1、课题一 菊花的组织培养,有丝分裂,受精卵,细胞分化,在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。,1、细胞分化的概念,一、知识回顾,黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合成黑色素；离体培养的上皮细胞，始终保持为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。,2、稳定性,3、不可逆性,细胞分化发生在整个生命进程中。,1、持久性,2、细胞分化的特点,造血干细胞 原红细胞 早幼红细胞 中幼红细胞 晚幼红细胞 成熟红细胞 死亡,4、普遍性,遗传物质没有改变，不同组织的细胞共同来源于受精卵，经有丝分裂产生。,3、细胞分化的实质,基因,在个体发育过程中，不同细胞中遗传信
2、息的执行情况不同即基因的选择性表达的过程,红细胞,合成血红蛋白 (不合成肌动蛋白),肌细胞,肌动蛋白基因开启,合成肌动蛋白 (不合成血红蛋白),肌动蛋白基因关闭,血红蛋白基因关闭,血红蛋白基因开启,试一试:现在你能解释这些现象了吗?,4、细胞分化的结果,细胞产生了不同种类的蛋白质即出现了不同的结构和功能,愈伤组织,胚状体,1958，美国，斯图尔德 植物组织培养,离体,二、基础知识,（一）植物组织培养概念,关键词： 外植体、脱分化、再分化、愈伤组织,在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其脱分化产生愈伤组织再分化形成丛芽，最终形成
3、完整的植株。,又称：植物离体培养,脱分化（或去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。,再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。,外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。,愈伤组织：细胞排列疏松、无规则、高度液泡化的无定形的薄壁细胞。,切取 形成层,无菌接种,诱导愈伤组织 的形成,试管苗的形成,培养室,移栽,脱分化,再分化,（二）植物组织培养的基本过程,植物组织培养过程,离体组织或细胞,植物体,脱分化,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,再分化,一般不需要光,需要光,（三）植物组织培养的理论基础-细胞全能
4、性,概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。 基础：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。 表达条件：离体条件 无菌操作 适宜物质的诱导和调节（植物激素） 适宜的营养物质 温度、酸碱度、光照等条件的控制,思考,这个试验说明了已经分化的细胞核具有什么特性？,高度分化的动物体细胞的细胞核有发育成完整个体的潜能,对比：多利羊的诞生,动物细胞有没有这种能力？,已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。,细胞全能性,思考,为什么已经分化的细胞具有全能性呢？,高度分化的细胞含有保持物种发育所需要的全套基因,1、培育无病毒植株,2、大规模培养愈伤组织（提取紫草素，治疗烫伤
5、和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）,4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法 （受体细胞为植物细胞）,（四)植物组织培养的应用：,3、人工种子（解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题）,三、影响植物组织培养的因素,1、材料的种类、年龄及保存时间长短等 2、营养 3、植物激素 4、PH、温度、光照等条件,1、植物材料的选择 -直接关系实验的成败,不同植物的组织培养难度不同 eg：烟草和胡萝卜的组织培养较为容易 枸杞愈伤组织的芽诱导比较难 菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。,2、营养-MS培养基,A、
6、大量元素: C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co,C、有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖,D、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等,、主要影响蛋白质、核酸的合成； K、 Ca、Mg、S主要影响酶的活性。,无机盐,强调：蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质；,MS固体培养基成分及比例,讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常
7、代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。,常用植物激素：生长素、细胞分裂素等 生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素 在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈加强的趋势 激素的使用顺序、使用的量及比例影响植物细胞的发育方向,3、植物激素的影响,生长素类：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。,细胞分裂素类：,激动素（KT）、6苄基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）等。,赤霉素类：
8、,赤霉酸（GA3）等,作用：2，4D有利于愈伤组织的生长； IAA、NAA、IBA有利于器官分化。,作用：促进细胞的分裂与分化，其中KT能 明显促进芽的分化而抑制根的形成。,作用：促进不定芽和幼株伸长。,激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：,供参考的配方,1、诱导菊花愈伤组织： 在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度均为0.5mg 、诱导菊花从芽： 在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度分别为2-3mg和0.020.03mg 3、诱导菊花生根： 在MS培养基各成分用量减半，并添加入NAA或IAA，质量浓度均为0.1mg,4温度、光照、pH的影响,光照：菊花每日用日光灯照射1
9、2h。,温度： 大多数植物组织培养控制在2327， 低于15时植物组织会表现生长停止； 高于35时对植物生长不利。 菊花的组织培养控制在1822。,pH： 不同植物对培养基最适pH的要求不 同，大多数控制在56.5。 菊花的组织培养控制在5.8左右。,制备MS固体培养基,外植体消毒,接种,培 养,栽 培,四、实验操作,移 栽,冲洗酒精无菌水冲洗氯化汞无菌水冲洗至少三次之上,配制各种母液 配制培养基 灭菌,（一）制备MS固体培养基,MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4保存配制好的培养基母液来制备,1、配制各种母液,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存,激素类、维
10、生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,2、配制培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml, 配制培养液, 调PH, 培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右, 酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s
11、，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟。,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,3、材料的切取和接种,将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成0.51cm的小段，用镊子夹取菊花茎段接种。,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入
12、体积分数为70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，形态学上端朝上，形态学下端朝下，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分,正常苗,污染苗,1、外植体带菌,2、培养基及接种器具灭菌不彻底,3、接种操作时带入,4、环境不清洁,污染途径,思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的
13、锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。,（四）培养,接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒 培养温度控制在18-22 每日用日光灯光照12h,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在2025的遮荫环境中，适应57d。试管苗不萎蔫，有新生长的趋势，便可移栽。,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,3、移栽,幼苗长壮后，移栽到土壤中,固体基质型，含水量高、 蓄水性强、透性好，适合栽培,珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而
14、成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩 。,蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。,（六）栽培,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌） 2、外植体的消毒（酒精、氯化汞） 3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灼烧） 4、无菌箱中的培养； 5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。,在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？,结果分析与评价,（一）对接种操作中污染情况的分析 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 （三）是否进行了统计、对照与记录 （四）生根苗
15、的移栽是否合格,五、课题延伸,1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养,2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季,扦插,嫁接,压条,练习 1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。 2.答：外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。,菊花的组织培养,再分化,材料性质、营养物质、 调节物质、环境条件,外植体的消毒,接种,基本原理:,细胞的全能性,基本过程:,脱分化,愈伤组织,影响因素：,操作流程：,配制MS固体培养基,培养,移栽,栽培,
