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1、研究生实验技能培训分子生物学实验常用仪器介绍,实验中心,Biometra梯度PCR仪,工作原理,多次重复“变性解链退火合成延伸”的循环,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ,PCR仪的应用领域,基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）,医学领域,疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗
2、中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测）,PCR具有极高的灵敏度,样品,正对照,负对照,标准分子量,污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。,因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。 用紫外灯破坏污染物也是一个办法,PCR仪器的变迁,三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 自来水冷却 （PE，1988） 电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 机械手 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热 （MJ,
3、 PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 风加热 Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）,PCR仪的种类,总体来说可以分为两大类： PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪 普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等。 1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪，此后很多公司如
4、Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪，,PCR仪的主要参数,温度控制要精确度 升降温的速度 更快的升降温速度，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，能提高PCR反应特异性。 ABI早就有升降温速度高达5C eppendorf也推出了升降温速度可达到6/秒和4.5/秒,现在的PCR仪如ABI，Eppendorf的一般具有两种温控模式，即模块温控模式（Block-control）和反应管温控模式）（tube-control）。 模块温控模式适用于长时间的静态孵育（如连接、酶切、去磷酸化等）。 试管温控更为准确,梯度PC
5、R仪,“摸条件”一度是让人很头疼的问题。 梯度PCR的出现部分解决了一些问题在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。,原位PCR扩增,在PCR仪上增加原位PCR模块就可以在玻片上进行原位PCR扩增，,多槽式高通量PCR仪,随着基因组高通量研究的需求的提高 MJ有一种一拖四，就是1个主机带4个扩增槽，每个槽可以独立控温，一次可以作96x4个样品的PCR，不过一旦出现问题4个都不能用了。 ABI则在原来的9700的基础上推出了双384孔的基座，一次完成384x2个样品，使得9700的功能又扩展到高通量领域而无需购买新的机器，可惜两个
6、384槽不能独立控温。 eppendorf则有一个控制面板，可以控制5个独立的PCR仪，每台机器可以联合，而且互不影响，但是比较浪费空间。,仪器的功能性和人性化设计,热盖现在的PCR仪一般均配备热盖，热盖温度设为105，使样品管顶部的温度达到105左右，蒸发的反应液就不会产生凝集在管盖上而改变反应体积，这样用户就无需再向反应管内加石蜡油，直接减少后继反应的麻烦。 过松 过紧,样品基座PCR反应多在0.2或者0.5的管子中进行，多数PCR仪也配备了不同的可更换样品槽适配不同的样品管。 eppendorf有一个有趣的设计，一个槽内带有0.2和0.5两种不同样品孔，不需更换基座就可以分别使用两种不同
7、的反应管 ABI的9700就可以更换不同的样品槽,软件新的PCR仪都比较注重程序编写的简易性。大屏幕，显示实时信息，倒计时，记忆存储多个程序、自动断电保护等都有助于实验室中的复杂环境使用。,Biophotometer生物分光光度计,技术参数,光学系统：吸收单光束分光光度计，配有基准光束 光源：氙灯 波长：氙230 nm; 260 nm; 280 nm; 320 nm; 562 nm; 595 nm 光谱带宽：5 nm：230 nm320 nm，7 nm：562 nm 595 nm 光度计测定范围：0000 到 3000 A,Biophotometer 生物分光光度计使用常见问答,答：DNA 的
8、在Biophotometer 上能测定的最高浓度并 没有一个绝对的值，这是因为这个浓度跟使用的比色皿光程和样品的稀释比例有关的。 Biophotometer 测定的最大吸光度是3.0。 当测定的DNA 样品吸光度大于2.5时，建议采用2 mm 的比色皿光程替代10 mm。 10 mm光程下测定的A260=2.5 时，相当于125 g/ml 浓度的双链DNA，1.25 g/ml 的1:10 稀释。 如果是在2 mm 光程6.25 g/ml 的1:10 稀释。,答：Biophotometer 在260 nm 下能够测定的最小吸光度是0.05，这个吸光度值相当于浓度为2.5 g/ml 的双链DNA
9、的吸光度（约125 ng 双链DNA 溶解在50 l 溶液中），请确保核酸样品的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值0.1。,答：Biophotometer 在260 nm 下能够测定的最小吸光度是0.05，这个吸光度值相当于浓度为2 g/ml 的RNA的吸光度（约100 ng 双链DNA 溶解在50 l 溶液中），请确保核酸样品的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值0.1。,答：请检查以下操作中的细节是否有所注意： 1 DNA 样品的A260 吸光度值是否0
10、.1。请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值0.1） 2 待测样品是否经过了充分的混匀，这样才能保证测定值的均一 3 待测样品中有相当含量的杂质。A260/A280 和260/A230是DNA 纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5下其比值应该在2.0 或2.5，A230 是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A280 是蛋白质的吸光度,答：产生四个加号的原因是因为测量的数值超过了测量上限3.0A，请检查 1 比色皿是否被完全压入比色皿槽内，出现加号有可能是比色皿的基座挡住了光线
11、的通路。 2 您使用的比色皿的中心高度是否在8.5 mm ？ 3 比色皿中是否加入了足够量的空白对照溶液？,答：A230 产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。 在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230 的负值会被校正。 同时需要注意的是A260 的读数也必需大于0.1 才能保证可靠的结果。,答：Bradford 方法中使用的试剂在和塑料长期接触后会使塑料发生损伤，这种试剂不可以在塑料比色皿中放置超过5 分钟，测定值的波动是由于试剂与塑料表面发生反应后，导致吸光度发生变化而产生的，在使用这个方法时，建议使用玻璃比色皿。,核酸与蛋白的电泳分析,琼脂糖凝胶
12、电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离效果比琼脂糖好，条带比较集中 可用于科研及检测分析,电泳槽,水平平板 垂直平板,垂直电泳系统,凝胶浓度选择,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,核酸电泳的指示剂,指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色
13、 二甲苯青：水溶液呈兰色 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当,载样缓冲液,指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便,核酸电泳的染色剂,最常用的染色剂 溴化乙锭 银染色,蛋白电泳的染色剂,最常用的染色剂 考马斯亮蓝G 考马斯亮蓝 R,溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在
14、电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察,银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收,BIO-PROFIL凝胶成像分析系统,主要用途,琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺电泳，DNA、RNA和蛋白质1D2D电泳凝胶，Southern Northern和Weste
15、rn印迹膜；点杂交膜；薄层层析板、TCL放射自显影胶片、菌落等样品的图像采集和分析，可对核酸、蛋白质的凝胶电泳条带进行分子量大小及含量分析。,基本组成,密闭型机箱：一体化全封闭暗箱，设计精巧；最大程度上避免紫外线对人体的伤害。 紫外透射台：紫外光源波长254/306/365nm，紫外透射面积20 x25cm。 白光板（可选）：透射面积20 x25cm 相机：带积分功能高清晰黑白摄像头；高分辨率数码相机；高分辨率专业数字黑白CCD摄像头。 镜头：电动/自动镜头。,主要用途（1）,图像获取 图像获取容易 可以以多种格式存储 获取粘贴板上的图像、与其它软件交换图像资源 图像复制功能，对所获取的原始图
16、像进行剪切、复制,主要用途（2）,图像处理 彩色图像转换为黑白灰度图像 图像的镜像和旋转 图像反色、即负片效果 图像的对比度亮度调整 图像的均匀化、平整区域、背景校正 图像的锐化、柔化、羽化、强化物体边缘,主要用途（3）,图像分析 条带定位：提取图象中的条带信息，确定泳道中是否有条带存在并定位 分子量计算：在输入Mark泳道中各条带的已知分子量后，由计算机求出指定未知条带的分子量和bp值（碱基对数）。 密度扫描：对指定泳道进行扫描，绘出扫描曲线，并计算出该泳道中各条带的密度积分和峰高 背景去除：多种去背景的方法，并可对扫描曲线进行去背景后矫正,离心机,Avanti J-301高速冷冻离心机,主要附件： 8*50ml角转（Max 30000rpm） 10*100 ml角转（Max 18000rpm） 6*38.5 ml水平转头（Max 24000rpm）,冷冻超速离心机,主要附件： 10*2ml角转（Max 130000rpm） 8*8 ml角转（Max 80000rpm）,工作原理,离心机: 利用惯性离心力分离液态非均
