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1、第九章 定点诱变与蛋白质工程,山东大学医学院生物化学 与分子生物学研究所 刘贤锡,蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等； 天然生物材料中蛋白质含量较少； 基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）； 多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途; 利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。,在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。 通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学
2、功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。 蛋白质工程的主要技术之一是定点诱变技术.,一、定点诱变的概念,利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点诱变（site directed mutagenesis）。 定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。,二、基因定点诱变的意义,用于研究基因的结构与功能；
3、 通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。,如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所
4、形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。 N端-笨丙-天冬-谷-甘- C端 多肽链,三、定点诱变的原理,定点诱变原理示意图,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,fo
5、r his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies,Kary B. Mullis,1/2 of the prize USA 1/2 of the prize Canada,Michael Smith,四、定点诱变的常用方法,（一）M13DNA寡核苷酸诱变,基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13 和为最常用。 M13噬菌体是一种环形DNA，基因组
6、大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replication form,RF）M13（RF- M13）。 广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage display)和单链核酸的制备。,单链丝状噬菌体(M13噬菌体),1.基本原理：,寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是: 首先制备单链核酸,即按体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基
7、因的M13单链DNA，即正链DNA。 再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。 因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质. 为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。,2.诱变过程,1)合成含有目的 基因的正链DNA； 2)合成含有特殊 突变碱基的引物； 3）制备异源双链 DNA（右图）； 4）富集和转化双 链DNA分子
8、； 5）筛选突变体并鉴定,（二）Kunkel定点诱变法,体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。 理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点诱变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。,因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将Kunkel 1985年建立的方法做以简单介绍。,基本原理： Kunkel定点诱变法是一种通过筛除含有尿嘧啶(U)的DNA模板链进行的寡核苷酸定点诱变法。
9、它的基本原理是: 将待突变的基因克隆入RF- M13 DNA载体上，导入含有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。 (细胞内的dUTP酶能将细胞内的dUTP降解,使其含量减少; ung能将误入DNA新生链中的dUTP切除.在dut和ung双缺陷的大肠杆菌中,新合成的DNA链中含有U.) dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后 以其为模板体外合成DNA的另一条链(不
10、含U)，双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其N-尿嘧啶脱糖苷酶切去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解。只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。,Kunkel定点诱变示意图,（三） PCR定点诱变,Polymerase Chain Reaction （PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。Kari.B.Mullis首创。,PCR原理简介,The principle： 以待扩增的DNA分子为模板，DNA变性后，以一对分别与模板5末端和3末
11、端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 反应体系的基本成分模板DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶、dNTP、含Mg2+的缓冲液。,包括如下基本反应步骤： 变性(denaturation:Heat to 95 to melt strands)，将反应系统加热至95，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 退火(annealling:Cool to55 to anneal primers with template strand)，将温度下降
12、至适宜温度（55左右）使引物与模板DNA退火结合； 延伸(extension:Extend primers with Taq polymerase)，将温度升至72，DNA聚合酶以dNTP为底物摧化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25-30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。,5 .AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA. 3 3 .TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT CACGT. 5 变性 退火(杂交) 5.AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 ATTC
13、GT 5 引物 5 AGGCTT 3 .T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT CACGT. 5 延伸 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA. .3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA. 3 .T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT. 5,5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA. .3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA. .
14、3 ATTCGT 5 5 AGGCTT TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA. .3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5,5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5 变性 退火 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 ATTCGT 5 5 AGGCTT 3 TCCGAAACG
15、GCTATCCGGT ATTCGT 5 延伸 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5,PCR定点诱变又称为PCR寡核苷酸定点诱变，该法具有简单、快捷的特点，其基本原理及操作程序如下： 将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中； 在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物1和3均含有错配核苷酸，但两个引物分别与质粒DNA的不同链不完全互补，引物2和4均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒DNA的引物1和3杂交链的互补链完全互补； 进行PCR扩增获得含有突变碱基的线型质粒DNA； 将两个反应管中的线型质粒DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有缺口的环状DNA分子； 转化入大肠杆菌，环状DNA分子的缺口可被大肠杆菌修复。如果同一反应管中的两个互补链又互相杂交，则继续形成线状DNA分子，在大肠杆菌中不稳定，易被降解。该方法把特异突变点导入克隆基因，无需把基因插入M13中，即可在大肠杆菌中进行表达。,PCR进行寡核苷酸 定点
