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1、第五节 酶组成、结构和作用机制,一、酶在生物体内的分布,GPT与尿激酶、心肌中的细胞色素氧化酶,生物体自身需要决定了酶的生物合成，酶的生物合成机制决定了酶在生物体内的分布和所处环境状态； 所以： 它们或定位于某亚细胞结构上处于“溶解”状态； 不同生物体细胞内酶的数量和种类不同； 同一生物体内的不同部位或不同生长发育 阶段的细胞内酶的数量、种类不同；,SOD,对微生物酶来说，合成后分泌有两种情况：,1、胞外酶（分泌型酶） 是指可以穿过质膜的任何酶，大多数 是水解酶，大多数工业用酶是胞外酶。 优点：它比胞内酶容易回收、纯化，不必 将细胞破碎，也不用去核酸，容易获得高产。,胞外酶的分泌位置由细胞和酶
2、的结构所决定 革兰氏阳性菌的外壳由细胞质膜和包在膜外面的壁组成。其有两类胞外酶： 合成后分泌到培养基中，如芽孢杆菌的淀粉酶、蛋白酶。 分泌蛋白穿过质膜后，结合于膜表面的胞外酶，当细胞形成原生质体时可部分或全部从膜上释放，如地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酯酶和-葡萄糖苷酶。 革兰氏阴性菌有4种不同位置的分泌型酶： 分泌蛋白结合在内膜外表面、分布在周质中、结合在外膜上、分泌到培养基中。,基因工程中外源蛋白最终在周质中表达的情况，常给工作带来许多麻烦。用基因工程手段获得的微生物高产外源酶常会被宿主本身的蛋白酶迅速降解。因此，尽可能的使产生的外源酶分泌到细胞质膜外，是稳定外源酶的有效措施之一。 关于胞外酶分泌
3、机制现在有一种信号肽假说。,2、胞内酶,是指合成后仍然在细胞内发挥作用的酶。 细胞本身结构的非均一性决定了酶分布和所 处状态非均一，或处于“溶解”状态，或定位 结合于某一特定的亚细胞结构中； 由于细胞器的分工，某些酶对特定细胞来说 是独有或主要的；各细胞器上往往集中了具 各自特征的酶系统（标记酶）。,对于标记酶,有以下几例： 质膜： 主要两种：Na+、K+-ATP酶、腺甘酸环化酶； 细胞核：主要是担负DNA与RNA合成的酶。如：RNA甲基转 移酶、乳酸脱氢酶等； 线粒体：主要集中了参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、呼吸 链、氧化磷酸化等与能量代谢有关的酶和酶系。 如：NADH脱氢酶、己糖激酶等； 溶
4、酶体：各种水解酶（约60种左右）； 内质网：蛋白质合成、脂类合成、药物转化的酶。 如：细胞色素还原酶、胆固醇酰基转移酶；,（一）酶的化学本质,1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。,1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。,核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。,二、酶的组成和结构特点,虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然有四级空间结构形式
5、， 一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架， 二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构， 三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘曲以形成包括主侧链的专一性三维排列， 四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。 具有低聚蛋白结构的酶(寡聚酶)必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。,（二）酶的组成,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子,辅因子,辅酶,与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,与膜蛋白结合得
6、紧密的小分子有机物。,金属激活剂,金属离子作为辅助因子。,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。 酶蛋白有3种组成形式:单体酶、寡聚酶和多酶复合物,（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物,1.单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。,2.寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。,3.多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。,1
7、、酶的活性部位 酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，只有少数特异的氨基酸残基参与底部结合及催化作用。这些与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位(active site)或活性中心(active center)。,(四) 活性部位和必需基团,通常又将活性部位分为结合部位和催化部位，前者负责与底物的结合，决定酶的专一性；后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。,（1）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，通常只占整个酶分子体积的 1%2%。 （2）酶的活性部分是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 （3）酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和
8、底物结合的过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置。 （4）酶的活性部位通常在酶的表面空隙或裂缝处，形成促进底物结合的优越的非极性环境。 （5）底物通过次级键较弱的力结合到键上。 （6）酶活性部位具有柔性或可运动性。,结合部位 Binding site 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,酶分子的结构特点,酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。 通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。 结合部位决定酶的专一性， 催化部位决定酶所催化反应的性质。,催化部位
9、 catalytic site,酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,调控部位 Regulatory site,必需基团：酶的分子中与酶活性有关的基团称为酶的必需基团(essential group)。,活性部位：必需基团虽然在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，这一区域称为酶的活性中心(active center)。,必需基团,活性部位必需基团,维持酶的空间结构（中心外必需基团）,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,2、必需基团,
10、必需基团分类,1）活性中心必需基团 催化基团：促进底物发生化学变化的基团称为 (catalytic group)。 结合基团：与底物结合的必需基团 活性中心中有的必需基团可 同时具有这两方面的功能。 2）活性中心以外的必需基团 不参加酶的活性中心的组成 但为维持酶活性中心应有的 空间构象所必需,主要包括： 亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。,酶活性中心的必需基团,酸碱性基团： 门冬氨酸和谷氨酸的羧基， 赖氨酸的氨基， 酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基 半胱氨酸的巯基等。,3、 研究酶活性部位的方法 （1）酶的专一性研究 （2）酶分子侧链基团的化学修饰法 非特异性共价修饰
11、特异性共价修饰 亲和标记（affinity labeling）法 （3）动力学参数测定法 （4）X射线晶体结构分析法 （5）定点诱变法,目前一般认为，酶催化某一反应时，首先在酶的活性中心与底物结合生成酶底物复合物，此复合物再进行分解而释放出酶，同时生成一种或数种产物，此过程可用下式表示：,1、酶与底物的作用过程中间络合物学说,上式中E代表酶，S代表底物，ES代表中间络合物)，P代表反应产物。由于ES的形成速度很快，且很不稳定，一般不易得到ES复合物存在的直接证据。但从溶菌酶结构的研究中，已制成它与底物形成复合物的结晶，并得到了X线衍射图，证明了ES复合物的存在。 ES的形成，改变了原来反应的途
12、径，可使底物的活化能大大降低，从而使反应加速。,四、酶的作用机制,酶的活性部位(activesite)是结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 活性部位通常在酶的表面空隙或裂缝处，形成促进底物结合的优越的非极性环境。 在活性部位，底物被多重的、弱的作用力结合(静电相互作用、氢键、范德华键、疏水相互作用)，在某些情况下被可逆的共价键结合。酶结合底物分子，形成酶-底物复合物(enzyme-substrate complex)。 酶活性部位的活性残基与底物分子结合，首先将它转变为过渡态，然后生成产物，释放到溶液中
13、。这时游离的酶与另一分子底物结合，开始它的又一次循环。,酶如何结合？ 已经提出有两种模型解释酶如何结合它的底物。 锁钥模型(lock-and-keymodel) ：1894年Emil Fischer提出锁钥模型，底物的形状和酶的活性部位被认为彼此相适合，像钥匙插入它的锁中，两种形状被认为是刚性的和固定的，当正确组合在一起时，正好互相补充。 诱导契合模型(induced-fitmodel)：是1958年提出的，底物的结合在酶的活性部位诱导出构象变化，此外酶可以使底物变形，迫使其构象近似于它的过渡态。 例如，葡萄糖与己糖激酶的结合，当葡萄糖刚刚与酶结合后，即诱导酶的结构产生一种构象变化，使活化部位
14、与底物葡萄糖形成互补关系。不同的酶表现出两种不同的模型特征，某些是互补性的，某些是构象变化。,锁钥学说：,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,“三点结合”的催化理论,认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,研究酶的催化作用机理，一般采用两种方法。 一种方法是从非酶系统模式获得催化作用规律，其优点是反应简单，易于探究，而其缺点是非酶系统与酶系统不同，其实验结果
15、不一定完全适合于阐明酶的催化作用。 另一种方法是从酶的结构与功能研究中得到催化作用机理的证据。 根据两种方法的研究结果，据现在所知，酶的催化作用可能来自5个方面，即广义的酸碱催化、共价催化、邻近效应及定向效应、变形或张力以及活性中心为疏水区域。,2、酶的催化作用机理,（1）广义的酸碱催化(acid-base catalysis) 酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。 狭义的酸碱催化剂即是H+与OH- 。广义的酸碱是指能供给质子(H+)与接受质子的物质。 酸碱催化剂是催化有机反应中普遍、有效的催化剂。它们在酶反应中的协调一致可能起到特别重要
16、的作用。由于生物体内酸碱度偏于中性，在酶反应中起到催化作用的酸碱不是狭义的酸碱，而是广义的酸碱。,在所有的广义酸碱的功能基团中以组氨酸的眯唑基特别重要，其理由有以下两点：一是咪唑基在中性溶液条件下有一半以质子供体(广义酸)形式存在，另一半以质子受体(广义碱)形式存在。它可在酶的催化反应中发挥重要作用；二是咪唑基供给质子或接受质子的速度十分迅速，而且两者的速度几乎相等，因此咪唑基是酶的催化反应中最有效、最活泼的一个功能基团。,Figure 8-9 Many organic reactions are promoted by proton donors (general acids) or proton acceptors (general bases). The active sites of some enzymes contain amino acid functional groups, such as those shown here, that can participate in the
