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1、手足口病的实验诊断,安徽省疾病预防控制中心 2009 . 3 . 11,手足口病的病原,手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）由人肠道病毒感染引起。 人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。,Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h,30nm 二十面体对称 无包
2、膜,人肠道病毒的毒粒结构,人肠道病毒发现的历史,脊髓灰质炎病毒：1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。 柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。 埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。 新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名（6971），最近，已经命名至102型,肠道病毒主要血清型,手足口病
3、的常见致病病原,多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为： 柯萨奇病毒A组的47、9、10、16型 B组的13、5型 埃可病毒的部分血清型 肠道病毒71型 最常见的为CV-A16和EV71,肠道病毒的抵抗力,肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。 对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56 30min都能灭活病毒 病毒在4可存活1年，-20可长期保持感染性 病毒RNA有感染性。,（一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期
4、保存的标本存于70冰箱。 （二）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病的标本采集,手足口病的标本采集,（三）血清标本 采集急性期(发病05天)和恢复期(发病1430天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集 (发病720天)血。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保存。 （四）咽拭子标本 采集病人发病3日内的
5、咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,（五）疱疹液 可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病的标本采集,标本采集器械要
6、求,注射器：医用（5ml和10ml）一次性注射器 棉拭子：塑料杆 全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈) 血清保存管：2 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 粪便保存管：5-20 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）-全国POLIO网络实验室,鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 痰液保存管：50 ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存） 尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀） 记号笔：油性，防水,标本采集器械要求,病人
7、标本的采集运输和保藏,在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液 中分离病毒具有很高的诊断价值。 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。,标本采集注意事项,标本采集注意事项,为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。 不能立即检测的标本应冷冻保存。 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。,手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病鉴定,手足口病的实验室诊断,手足口病的实验室诊断方法,病毒分离 抗体检测 核酸检测 蛋白/核酸芯片,手足
8、口病的实验室检测流程,病毒分离培养,用于病毒分离的标本： 包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本 适用的细胞 RD细胞（人胚胎横纹肌肉瘤细胞）、Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞）,病毒分离培养,标本的处理 1、粪便：2g 加PBS 10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子， 4下 10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 3、脑脊液和疱疹液：直接接种,病毒分离培养,培养观察： 36培养逐日观察，第1代培养见可疑CPE 至观察满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后, - 2
9、0或- 70冻存以备进一步鉴定； 如果7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续观察，盲传2代后仍不出现CPE则判定为阴性； 鉴定：中和试验,血清抗体检测,方法 中和实验、 ELISA IgM：单份血：急性期 IgG ：双份血：急性期，恢复期 阴转阳，四倍升高，四倍降低均可诊断近期感染,病毒核酸检测RT-PCR, RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR) 用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进行，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开始PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合
10、酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。,病毒核酸检测RT-PCR,方法特点： 快捷、简便 高度灵敏、特异 具有病原诊断意义 高效的通用型技术平台,粪便标本：采用氯仿进行处理。 肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4下，10000 rpm离心20min 。 疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。,标本的预处理,可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA 简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰 QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本 QIAGEN Rneasy Mini
11、 Kit（CAT： 74104） 适合组织和咽拭子标本,RNA的提取,引 物,人肠道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸检测通用引物 PE2（上游）：5- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3 PE1（下游）：5- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3,EV71核酸检测引物序列： EV71-S（上游）：5- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3 EV71-A（下游）：5- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3,引 物,CA16核酸检测引物序列： Cox A1
12、6-S（上游）：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3 Cox A16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3,引 物,根据自己实验室的实际情况建立各自RT-PCR反应体系 配下列试剂主溶液： 10PCR Buffer（含Mg2+）5.0l dNTPs（2.5mM each） 2.0l 上游引物（0.1g/l）1.0l 下游引物（0.1g/l）1.0l RNA酶抑制剂（RNasin,40U/l） 0.5l Taq DNA聚合酶（5U/l） 0.5l AMV逆转录酶（10U/l） 1.0l 模板RNA 3.0l RNase Free dH2
13、O 36.0l 50.0l,反应体系,在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下： 4245min 953min 9520s 5025s 32个循环 7230s 7210min 4Soak,温度循环参数,通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。,结果解释,RT-PCR实验结果解释,实验室诊断原则,人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。 一般采取的原则为： （1）病毒分离阳性率远高于对照人群
14、； （2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染； （3）从病变组织中分离出病毒。,从疑为肠道病毒感染的脑炎/脑膜炎患者的脑脊液中检测到相应的肠道病毒核酸（RT-PCR法），或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒引起的中枢神经系统感染。 从疑为死于EV71（或其它肠道病毒）的尸检标本中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，即可证明是该肠道病毒是病因。 从HFMD患者的疱疹液中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒，那么该病毒就是病因病原。,实验结果的诊断意义,实验结果的诊断意义,当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据
15、。肠道病毒有时引起无症状感染，只从个别HFMD患者粪便标本中分离到EV71（或其它肠道病毒）时，不能轻易下结论EV71是病因，应该扩大样本量，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。,手足口病检测实验室相关问题,1、实验室生物安全问题：必须重视的问题 实验人员受过生物安全培训 有防范潜在生物危害的意识 熟悉生物安全规程，掌握生物安全技能 实验室自己的生物安全指南 合格的生物安全实验室 实验室文件化的规程及方法（包括常规的和特殊的）,2、PCR实验室质量控制问题： 保证实验结果可靠的必要手段 实验对照：阳性、阴性、试剂、空白对照 控制实验室核酸污染 试剂污染 器械污染 实验过程污染,手足口病检测实验室相关问题,手足口病检测实验室相关问题,3、实验结果的应用问题： 综合分析、排除干扰、合理运用 阳性结果：排除假阳性干扰 分析阳性结果的价值 阴性结果：分析可能的原因（样品采集？过程规范？核酸降解？试剂质量？临床信息误导？）,欢迎指正 谢 谢,
