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1、第十二章基因工程与蛋白质工程,第一节 生物工程概述,第二节 基因工程,第三节 蛋白质工程,第一节 生物工程概述,一、生物工程概念及研究技术,二、在现代工、农、医领域中的应用,一、生物工程的概念及研究技术,1.基因工程在分子水平的遗传操作技术,2.细胞工程遗传物质在细胞间的转移,4.生化工程生物工程产品的最终取得手段,3.酶工程酶的改造和设计,二、生物工程在现代工、农、医领域中的应用,1.化工及冶金工业,2.轻工和食品工业,4.农业和畜牧业,3.医药工业,5.环保和能源工业,基因工程包括DNA重组技术和其他使基因结构得以定向改造的技术。本节主要介绍DNA重组技术，大体上包括下列5个步骤。,DNA
2、重组的 技术路线,1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组 体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定,第二节 基因工程,一、目的基因的获得,二、基因载体,三、重组DNA的筛选及表达,一、目的基因的获得,1.限制酶特异性切割DNA的手术刀,2.取得目的基因的方法分离法及合成法,1. 限制性内切酶,DNA重组即是将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程 实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的,限制性内切酶：一类核酸内切酶，可以将外源DNA在特定位点切割降解 。以后从细菌中分别分离出了I型和型两类限制性内切酶。,限制性内切酶的命名,用细菌同名的第一个字母（
3、大写）和种名的前两个字母（小写）构成酶的基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如HaeII是从（Haemophilus aegypticus）中提取的，并且是从中发现的第二个酶。,限制性内切酶切割DNA的方式,a.从识别序列的中间切开 b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 c.在识别序列对称轴的右边（5-3链）和对称轴左边（3-5链）切开,a.从识别序列的中间切开,从识别序列的中间切开产生平齐末端（bluntends）， 如Hae,b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割,即分别在5-3链和3-5链对称轴的
4、左右方切开 ，形成带有凸出的5磷酸基团的粘性末端（Cohesive ends），如EcoR,c.在识别序列对称轴的右边（5-3链）和对称轴左边（3-5链）切开,形成带有凸出的3羟基的粘性末端，如pstI,2.取得目的基因的方法 分离法及合成法,（1）DNA片段的直接提取,（2）用噬菌体或质粒直接从宿主细胞中将目 的基因携出,（3）使用相应的mRNA分离基因,二、基因载体,1.质粒染色体以外的遗传单元,2.噬菌体感染细菌的病毒,质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠杆菌素因子和抗药因子等,抗药因子（质粒）在其DNA上编
5、码有某些酶的基因，表达产生的酶对链霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四环素、卡那霉素等药物能产生生物化学修饰，使之钝化而失效,1.质粒染色体以外的遗传单元,质粒的作用,质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。 质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。,目前所使用的质粒,目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用
6、于DNA重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源DNA的酶切位点，并含有特殊的筛选标记 这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体,pBR322质粒的结构,以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。 我们常常采用噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源DNA导入宿主细胞。,2.噬菌体感染细菌的病毒,以噬菌体为载体进行DNA克隆,DNA,用限制性内切酶除去中间一段,与外源DNA连接,重组载体的体外包
7、装,带有外源DNA的噬菌体,太小不能被包装,三、重组DNA的筛选及表达,1.转化带有目的基因的载体进入受体细胞,2.筛选从大量受体细胞选出带有重组体的细胞,3.表达外源DNA在受体细胞的转录和翻译,1.转化带有目的基因的载体进入受体细胞,由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成“感受态”细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。 由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。,噬菌体感染大肠杆菌的途径,2.筛选从大量受体细胞选出带有重组体 的细胞,（1）插入失活法,（2）放射性探针检测法,（3）R-环检测法,（4
8、）免疫测定法,（1）插入失活法,在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。,pBR322质粒结构,如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活,如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活,（2）放射性探针检测法,利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检测有外源DNA插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。,（3）R-环检测法,在有利于形成R-环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA的缓冲液中局部变性。如若质粒DNA存在着与mRNA探针互补
9、的序列，mRNA就会取代DNA中一条链，与另一条链形成双链杂交分子，从而形成R-环结构，在电子显微镜下观察，可直接观察到R-环。这样可检出重组体质粒DNA。,（4）免疫测定法,免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。,Southern和Western印迹法,DNA frangment,Electrophoresis,Transfer of DNA by blotting,32P-labled DNA probe,Autoradiography,Agarrose gel,Autoradiogram,Nitrocellulose sheet,Autorad
10、iogram,Polymer sheet,SDS-Polyacrylamide gel,Transfer protein,Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody,Protein band detected by specific antibody,Autoradiography,3.表达外源DNA在受体细胞中的转录和翻译,带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。,第三节 蛋白质工程,一、蛋白质工程的概念,二、蛋白质工程的一般
11、技术,三、蛋白质工程的应用,一、蛋白质工程的概念 蛋白质工程(protein engineering)：通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术,1、基因定点突变定做新蛋白质 2、蛋白质设计对天然蛋白质的修饰,蛋白质工程 举例：,定点突变技术： 已知丝氨酸是由TCT编码，只要把C改为G，就变成半胱氨酸的密码TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有TGT外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火（假如退火在适宜温度下进行，约15个碱基中，有一个碱基
12、错配是可以容忍的）。然后由DNA聚合酶延伸引物，由DNA连接酶将双链再连接成环，转入宿主细胞复制，即产生两种子代质粒。一半的顺序中含有TCT顺序，另一半含有TGT顺序。表达具有TGT顺序的质粒，即可以产生在同一部位上半胱氨酸代替丝氨酸的蛋白质。,二、蛋白质工程的一般技术 1、蛋白质工程的理论设计蛋白质工程的前提 2、点突变法基因修饰的方法 （1）基因的全化学合成 （2）基因直接修饰法 （3）盒式突变技术,三、蛋白质工程的应用 1、蛋白质工程酶酶特性的改造 （1）改变酶的催化活性 （2）改变酶的底物专一性 （3）提高酶的稳定性 （4）酶的反应特性改变 （5）产生新酶 2、合理药物设计蛋白质工程用于新药研制 譬如：胰岛素原的人工合成,胰岛素原的人工合成,胰脏,(A)n 胰岛素原mRNA,cDNA,重组质粒,转化细菌,mRNA,反转录酶,胰岛素原基因,与质粒连接,感染E.coli,胰岛素原,The End 谢谢观赏,Game Over！,
