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1、血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,检验教研室,一、血脂测定,血脂测定项目 TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、ApoAI、ApoB等。 检测项目的合理选择 临床常规血脂测定：TC、TG、HDL-C 及LDL-C这四项，有条件的实验室可测定ApoA、ApoB及Lp(a)。 特殊检查项目：如Apo（A、C、C、C和E）、FFA、CETP、LPL、LCAT测定等，多用于科研或临床特殊病例研究。,血脂和脂蛋白检测前应注意的问题 分析前主要影响因素有： 1.生物学因素 如个体间、性别、年龄和种族等。 2行为因素 如饮食、肥胖、吸烟、紧张、饮酒、饮咖啡和锻炼等。 3临床因素 如疾病继发；药物诱导4标
2、本收集与处理,建议： 1抽血前2周保持平时的饮食习惯。 2抽血前3天避免高脂饮食，24小时内不饮酒，不作剧烈运动。 3应在禁食1214小时后空腹抽血。 4除卧床的患者外，一般应坐位休息5分钟后抽血。 5抽血前最好停用影响血脂的药物数天或数周，否则应记录用药情况。,（一）血清外观分析（血清冷置试验）,（二）血清总胆固醇测定 胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。 TC测定方法很多，约200多种，分为化学测定法、酶法、气相
3、色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。,1、化学测定法 主要有两类 （1）Liberman-Burchard反应 简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸。呈色稳定性差。 （2）Zak反应 胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。,2、酶法 胆固醇酯 胆固醇 脂肪酸 胆固醇 O2 胆烷-4-烯-3酮 H2O2 H2O2 4AAP 酚 红色亚胺醌 H2O,CEH,C
4、hOD,POD,试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。 酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，CEH对胆固醇水解不完全，表面活性剂影响CEH活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原H2O2使结果偏低。,【参考范围】3.105.70mmol/L 【临床意义】血清TC含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响。20岁以上随年龄而，70岁以后则有下降趋势。2040岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性。城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关。脑力劳动者高于体力劳动者。 病理性高胆固醇血症 原发性高
5、胆固醇血症、糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退。 病理性低胆固醇血症 严重贫血、甲亢、营养不良。,（三）血清甘油三脂测定 TG是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，临床化学中往往以测定甘油代表TG的含量。TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。,1、化学法 基本步骤可归纳为四步 （1）提取：甘油三脂的提取 采用合适的溶剂，使脂蛋白变性提取TG，同时去除干扰物质(磷脂、游离甘油、葡萄糖等),常用方法有： 1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土
6、）吸附。 2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。 3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。应用较广。,（2）皂化：甘油三脂的水解 一般都采用KOH乙醇或KOH异丙醇溶液，60，515min可使TG完全水解。 （3）氧化：甘油的氧化 最常用的氧化剂是HIO4，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸。反应受-磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰。,（4）显色：显色测定甲醛。常用方法有： 1）甲醛与变色酸（4.5-二羟-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（570nm） 2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3.5-二
7、乙酰-1.4-二氢-2.6-二甲基吡啶。（420nm）,2、酶法 常用的有： （1）磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP 3-磷酸甘油 O2 磷酸二羟丙酮 H2O2 H2O2 4-AAP 酚 红色亚胺醌 H2O 试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低。,LPL,GK,GPOD,POD,（2）乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH 法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP ADP 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP 丙酮酸 丙酮酸 NADHH+ 乳酸 NAD+ （3）甘油氧化酶法
8、第一步消除血清中原有的甘油：,LPL,GPOD,PK,LDH,游离甘油 O2 甘油醛 H2O2,GlyOD,H2O2 EMAE 无色物质 EMAE称N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一种还原剂，灵敏度比酚高。第二步测定甘油三脂水解释放的甘油： TG H2O 甘油 FA 甘油 O2 甘油醛 H2O2 H2O2 4-AAP EMAE 有色化合物,POD,GlyOD,LPL,POD,【参考范围】0.561.70mmol/L 【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。 1.病理性增高 原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。 2.病理性降低 甲
9、亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。,(四)血清（浆）脂蛋白测定 1、血清脂蛋白电泳 临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶。 （1）血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳 以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带。,（2）血清脂蛋白预染琼脂糖电泳 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带。 凝胶浓度一般为0.5%，超过1%，-Lp与pre-Lp不易分开，0.5%，凝胶机械强度太低。 血清：染料为9：1，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会
10、引起蛋白质变性，影响分离效果。,结果判断，直观区带的着色深浅，宽窄，用浅染，稍浅染，深染及消失加以描述；或用光密度扫描仪测定。 【参考范围】 -Lp 30%40% pre-Lp 13%25% -Lp 50%60% CM （）,2、血清高密度脂蛋白测定 常以测定HDL-C含量代表HDL水平。测定步骤包括HDL的分离；测定HDL中胆固醇。 HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法。临床实验室常用沉淀法。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷钨酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。,如：磷钨酸- Mg2+选择性地沉淀血清中的L
11、DL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇。 【参考范围】 男 1.280.33mmol/L 女 1.370.33mmol/L 【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素。,3、血清高密度脂蛋白亚组分测定 HDL有三个亚类（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亚类与冠心病危险度的相关程度比总HDL-C更密切。 HDL2 d = 1.0631.125g/ml HDL3 d = 1.1251.210g/ml HDL2脂类60% 蛋白质40% ； HDL3脂类45% 蛋白
12、质55%,高密度脂蛋白亚组分的分析方法有超速离心法、柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、多价阴离子分级沉淀法。 其中多价阴离子分级沉淀法具有快速、经济、简便更为实用，是目前临床实验室最常用的方法。常用的沉淀剂有硫酸葡聚糖- Mg2+、聚乙二醇（PEG）。,【原理】用PEG做沉淀剂，以不同浓度的PEG在不同pH条件下分别将VLDL和LDL（沉淀剂 95g/L PEG，pH6.5）HDL2（沉淀剂 170g/L PEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀剂）和HDL3（沉淀剂），然后用酶法测定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C减去HDL3-C的差即为HDL2-C的含量。 【参考范围】
13、HDL2-C 男 0.530.17mmol/L 女 0.620.22mmol/L HDL3-C 男 0.750.17mmol/L 女 0.750.16mmol/L,4、低密度脂蛋白测定 低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C测定方法很多，常用的有： （1）Friedewald公式法 LDL-C TCHDL-C 或 在一般情况下能得到可被临床接受的近似结果，但TG4.25mmol/L时不能应用此公式计算，否则结果偏差太大。,mg/dl,mmol/L,（2）聚乙烯硫酸盐沉淀法 聚乙烯硫酸（PVS）能选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL和VLDL）胆固醇，即得LDL
14、-C值。试剂中加入EDTA去除两价阳离子，避免VLDL共沉，辅以聚乙二醇独甲醚（PEGME）可加速沉淀。 （3）直接测定法 匀相的LDL-C直接测定法是以不同的表面活性剂的双试剂使非LDL-C与LDL-C分两步水解，因先消除非LDL-C，故也称为消除法。,【参考范围】LDL-C3.12mmol/L 【临床意义】LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要危险因素。,5、脂蛋白（a）测定 脂蛋白(a)是由载脂蛋白(a)与载脂蛋白B100通过二硫键连接所形成的特殊蛋白。脂蛋白(a)测定的方法目前常用的是ELISA法。 血清中的脂蛋白(a)与单克隆抗Lp(a)抗体结合，再与过氧化物酶结合，形成Lp(a
15、)-单克隆抗体-酶复合物，然后与底物孵育显色。,【参考范围】120180mg/L 【临床意义】Lp（a）动脉粥样硬化、冠心病的独立危险因素，与动脉粥样硬化成正相关。血清Lp（a）浓度300mg/L时，其冠心病的发病率高于健康人的25倍。血清Lp（a）水平主要决定于遗传，个体间Lp（a）水平差异很大，但同一个体血浆Lp（a）水平的变化较小，环境、饮食、药物对它的影响不明显。,（五）血清载脂蛋白A及B测定 脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分为A、B、C、D、E、F、G、H八类，其中ApoA，B，C还有亚类。 ApoA是HDL的主要蛋白质，占HDL蛋白质的
16、85%左右，它的血清浓度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白质，占LDL蛋白质的97%左右，ApoB浓度主要反映LDL水平。,Apo的测定方法主要有三类：层析分离，然后再按一般蛋白质定量；电泳分离后经染色光密度扫描定量；各种免疫分析法。 层析法操作麻烦，一般只用于研究；电泳法简便灵敏，但各类Apo染色性能不一致，重复性不好；免疫法特异性好，灵敏度高，不需预先分离脂蛋白，适合临床实验室的应用，但需特异抗血清。,【参考范围】 ApoA 1.001.50g/L ApoB 0.801.00g/L 【临床意义】 ApoA是HDL的主要结构蛋白，ApoB是LDL的主要结构蛋白，因此，ApoA和ApoB可直接反映HDL和LDL的含量。但在某些病理情况下，ApoA与HDL和ApoB与LDL并非成正相关，临床上常将ApoA和ApoB比值作为冠心病的危险指标。,
